动物病毒学-实验三 传代细胞的培养与细胞活力检测.ppt

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1、实验三传代细胞的培养与细胞活力检测（以猪肾细胞IBRS-2为例）了解不同传代细胞的形态以及传代方法掌握IBRS-2细胞的传代方法掌握细胞活力测定的操作步骤、计算方法及含义一、实验目的细胞培养的基本概念细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。培养细胞的特性培养细胞的生长方式：贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。

2、多为各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程：游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期（平台期）游离期：细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟-5小时。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在10分钟－5小时内贴壁。潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。细胞培养中的污染1、细菌污染细菌污染是实验室细胞

3、培养中常见的污染，即使在细胞培养基中加入了抗生素，也可能因为操作不慎而引起污染。培养细胞受细菌污染后，会出现培养基变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，培养细胞受真菌污染后，可见培养基中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养基一般不发生混浊。倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。3、支原体污染4、病毒污染5、

4、非同种细胞污染二、材料吸管、吸球IBRS-2细胞一瓶0.25%胰酶生长液（含10%血清）台盼蓝（0.4%）细胞计数板消化液(胰蛋白酶或者胰酶）胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞之间以及细胞和底物的粘连，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca、Mg离子的PBS缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％，0.22µm滤膜过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：细胞种类不同消化时间也不一样，一般是1-10分钟。含血清的培养基可

5、以终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。血清常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。非胎牛血清需要灭活以减少补体和支原体的影响：56℃，30分钟。CO2培养箱超净工作台实验设备与器材倒置显微镜滤器超纯水仪培养瓶、培养板、培养皿三、常用传代细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞MDCK：犬肾细

6、胞TK-143：胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞IBRS-2PK-15Marc-145BHK-21四、传代细胞培养的条件要求细胞密度：2-3×105个/mlpH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8培养温度哺乳动物细胞一般为37℃昆虫细胞28-30℃五、传代细胞系培养方法第一次开始培养某种细胞时，一定要查清楚关于该种细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂，通常的消化时间、传代时间等。IBRS-2细胞是猪肾传代细胞系，染色体已发生改变，不再保持原细胞的二倍体组型，可以无限地传代贴壁较紧，消化时间较

7、长取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。加入1ml胰酶轻摇细胞瓶，静置1min，洗掉漂浮的和贴壁不紧的细胞，弃去胰酶；重复一次，将细胞瓶倒置放入温箱中消化消化5min左右，加入6ml生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，丢掉部分细胞，留下2ml细胞（1:3传）加入生长液补足6ml，然后置37℃培养箱培养，培养2天左右即可长成单层。操作步骤：在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，细胞培养过程中有时需要测定细胞的活力以了解细胞的生长状态。此外，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以

8、了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。六、细胞活力检测的原理细胞活力分析可以测定细胞悬液中存活细胞的百分比。一般通过染料排除的染色方法实现，即具有完整细胞膜的细胞能够将染料排除在外从而不被染色，而不具备完整细胞膜的细胞则能够吸收染料而被染色。用于排除染色法的