传代细胞的常规培养

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1、当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面由于细胞密度过大，细胞与细胞Z间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物枯竭和代谢物积累而不利于牛长或发牛屮毒。因此需要将培养细胞进行分离扩大培养，细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的这个过程称为传代（passage）或者再培养（subculture）01）传代标准传代吋间一般通过两个方面进行确定：一是在细胞培养过程屮，当培养液由于pH值卜•降而呈现黄色时，表明细胞已经达到最大密度，需耍换液或进行传代培养；二是观察细胞形态，健康细胞形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。初代培养的首次

2、传代很重要，是建立细胞系的关键时期。在首次传代时一般要特别注意以下3点：①细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面之前，不要急于传代。②原代培养吋细胞多为混杂牛长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很常见。传代时不同的细胞有不同的消化时间，因此耍根据需耍，注意观察及时进行处理，并可根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间不同而分离和纯化所需要的细胞。另外早期传代的培养细胞较己经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧，尽可能减少对细胞的损伤。③首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境有利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传人新的培养瓶。2）生长周期

3、和传代比例体外培养技术屮所谓的传“代”概念并不等于细胞牛物学屮“亲代细胞”与“子代细胞,，中“代,,的概念。传代培养的实质就是分离后再次培养，进行一次分离再培养称Z为传一代，传代数可以衡量培养物的培养年龄。传代是细胞分裂造成的结果，细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束为一个细胞周期，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期能准确表示细胞增殖速度。两次细胞分裂Z间的时间也可以用细胞世代时间来表示，所以细胞周期指细胞一个世代所经历的吋间。正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。传代代数与细胞的世代数（增殖代数）并不是同一个概念。在细胞培养时，所说的“第6代细胞

4、些旨细胞已经传代6次。以贴壁细胞为例，每传代一次，大概要倍增3〜6次，细胞要经历如下生长过程：游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和停止期（平台期）。当细胞达到平台期时，就要进行传代培养，否则细胞会小毒,发生形态改变。甚至死亡。培养细胞有密度依赖和接触抑制的特点，细胞浓度过低，不易存活，表现为细胞在达到增长前有较长的滞留期；细胞浓度过高，发生接触抑制后生长迟缓甚至死亡，所以传代比例通常按仁2〜1:4的稀释度进行。传代后细胞的接种浓度一般为5x10的5次方/mL。细胞传代方法1）概述2）根据不同细胞采取不同的培养细胞传代方法。悬浮生长的细胞可以用直接吹打或离心分离后传代，或门然沉降

5、法吸除上清后，再吹打传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代。3）细胞传代培养时常用的酶为胰蛋门酶，它可以破坏细胞与细胞、细胞与培养瓶之间的细胞连接或接触，从而使它们之间的连接减弱或完全消失。经胰蛋白酶处理后的贴壁细胞在外力（如吹打）的作用下可以分散成单个细胞，再经稀释和接种后就可以为细胞生长捉供足够的营养和空间，达到细胞传代培养的目的。2）方法（1）贴壁细胞的消化法传代①吸除或倒掉瓶内旧培养液。②向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液），轻轻摇动培养瓶，使消化液流过所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加I〜2mL新的消化液,轻轻摇动后

6、再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤，直接加消化液进行消化。③最好在37°C或25qC以上室温环境下进行消化。消化2—5min后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现细胞质回缩、细胞间隙增人后，应立即终止消化。④吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hank*s液数毫升。轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。⑤用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程耍顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不耍岀现泡沫，这些都会对细

7、胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。⑥让数，分别接种在新的培养瓶内。（2）悬浮细胞的传代因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3,然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。悬浮细胞常采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800〜1000r/min离心5min,去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液，然后传代接种。(3)半悬浮细胞的传代半悬浮细胞部分呈现贴