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时间:2020-03-09
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1、β-地中海贫血β-地中海贫血是一种由于β-珠蛋白基因突变导致肽链合成减少或缺乏而产生的单基因遗传血液病,多由β-珠蛋白基因点突变所致。在中国人群中常见的突变位点有CD41-42M,-28M,IVS-II-654M,CD71-72M等突变类型编码区的移码突变、无义突变和起始密码突变:如CD41-42,CD71-72,CD17突变后形成终止子,表现为β0。非编码区IVS-1和IVS-2突变如IVS-II-654突变影响mRNA的拼接,表现为β+。影响转录的突变:如-28,-29的突变影响基因的转录,表现为β+。β-地中海贫血基因诊断操作流程β-地中海贫血
2、基因诊断试剂盒可对17个突变位点(8个常见位点及9个少见位点)进行检测位点设计合理,绝大部分突变位点都有相应正常对照,结果易于判定检测原理(PCR与反向点杂交)反向点杂交(RBD)根据检测位点碱基的差异,按照碱基互补配对的原则,设计特异性识别某种基因型的寡核苷酸探针组合(正常探针和突变探针),分别固定在尼龙膜的特定位置上,制成检测膜条。设计特异的PCR引物且其5‘端用生物素进行标记,扩增获得一定长度的DNA片段,该片段包含了所要检测的各个位点。PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应,观察检测膜条上各位点信号的有无(信号为蓝色斑点),判断该探针
3、是否与PCR产物杂交,从而确定待测样品的基因型。杂交信号的检测则在引物末端标记生物素,再通过抗生物素辣根过氧化物酶(POD)催化底物显色而观察杂交结果。检测原理(PCR与反向点杂交)反向点杂交技术膜条显色原理生物素链霉亲和素-过氧化物酶复合物TMBH2O2固定在膜上的探针变性及杂交1、取15mL塑料离心管,放入标有样本编号的膜条,加入A液5-6mL及所有PCR产物。拧紧管盖,在稍微拧松。2、将塑料管放入沸水中加热10分钟,取出拧紧盖子,放入43℃杂交箱杂交1.5—4小时。3、取50mL塑料离心管,加入45mlB液于杂交炉中预热至43℃。洗膜取出膜条,
4、移至装有预热B液的50mL管中,于43℃轻摇洗涤15分钟显色1)POD溶液孵育30分钟2)洗涤:用A液室温洗两次,每次5分钟。3)洗涤:用C液室温洗膜1-2分钟。4)显色将膜条浸泡于显色液中避光显色10-15分钟即可见斑点显现。β-地中海贫血基因诊断结果判读41-42N654N-28N71-72N17NβEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MβEM31MIVS1-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS1-5MN/N结果判读654M/71-72M17M/NβEM/βEM41-42M/N结果判读6
5、54M/N43M/N-28M/N结果判读41-42M/71-72M654M/-28M41-42M/-28M43M/N结果判读41-42M/41-42M-29M/NIVSI-1突变思考题1、PCR-RDB检测β-地中海贫血的基本原理是什么?2、本实验可以检验血红蛋白基因的哪几种突变?下节课预告1、阶段小测2、实验汇报3、观看录像4、总结
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