植物生理学实验课件植物衰老生理2018秋冬.ppt

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1、植物衰老生理1植物组织中可溶性蛋白的测定DevelopmentalsignalsEnvironmentalsignalsDisassemblyofcellularcontentsanddegradationofmacromoleculesCelldeathDecreaseinphotosynthesis,activationofsenescenceprogram实验原理衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。衰老时的生理生化变化蛋白质显著下降,核酸含量的变化,光合速率下降,呼吸速率下降,生物膜结构变化,植物内源激素的变化等。实验原

2、理植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。自由基代谢失调,并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA可溶性蛋白测定的原理考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从0~1000g/ml。据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含

3、量。实验步骤制备蛋白提取液称叶龄差异明显的叶片各0.50g，加入5.00ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下（4C）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。注意：2人1组离心前平衡蛋白标准曲线的制作蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0.15MNaCl溶液中，制成1mg/ml的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160μg/200ul牛血清蛋白的标准溶液。考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂的配制0~100g/ml蛋白标准曲线的制作准确吸取0.2ml各含0、40

4、、80、120、160μg牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。显色反应样品的测定：取40l蛋白提取液+160l磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。可溶性蛋白质含量的计算可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg）×提取液体积/（

5、测定加样量*鲜重）植物衰老生理2植物组织中丙二醛的测定MDA测定MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰600nm处消光系数为155(mM)-1cm-1MDA的测定取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92ºC水浴保温30min空白管：1mLPi-buffer+TBA与TCA混合液4.0ml（92ºC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min;5000rpm测定A532,A450和A600MDA含量计算公式L为比色杯厚

6、度(cm)MDA(mM)=——————155xLA532-A600•••••••••Equ.1蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450•••••••••Equ.2进一步求出单位鲜重植物组织中的MDA含量第二次离心的目的何在？植物组织中那些物质对丙二醛测定（TBA法）干扰较大？研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温？植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定高等植物叶片中SOD活性随衰老而下降。O22+2H2OH2O2+O2SOD测定原理四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产

7、生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-,抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含量。（但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬液,做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检测的极端条件,使得该法实验数据重现性差;同时,在560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的SOD,也无法获得100%的对O2.-抑制率.为此,人们在增加甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。）试剂NB

8、T反应液含50mMPi-buffer(pH7.8),13mM甲硫氨酸，63μMNBT,1.3μ