浙大植物生理学报告植物衰老生理

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1、沖戸丿、岁实验报告专业：生物系统•丁程姓名：缪宏樑学号：3120100211日期：2014.5.29地点：生物实验屮心313课程名称：植物牛理学实验指导老师：成绩:实验名称：植物衰老牛•理实验类型：定量同组学生姓名：朱圣日美二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得一、实验目的和要求1.掌握可溶性蛋白测定的原理;2-掌握植物组织中丙二醛的测定方法;3.掌握植物组织中超氧物岐化酶(S0D)活性测定方法；4.了解植物衰老的原理。二、实验内容和原理衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终

2、自然死亡的过程。衰老时的生理生化变化:蛋口质显著下降，核酸含暈的变化，光合速率下降，呼吸速率下降，生物膜结构变化，植物内源激素的变化等。植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少(可溶性蛋白)。自由基代谢失调，并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA①可溶性蛋白测定的原理考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm,并表现出在595nm处的吸收值与溶液屮的蛋白质含量有线性关系，其范围从0^1000g/mL据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。待测样品经缓冲液提収后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提収

3、液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测定595nni吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。②MDA测定原理：MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰600nm处消光系数为155(mM)-lcm-1③超氧物岐化酶(SOD)活性测定原理：SOD20穿+2比0H2O2+O2四氮哇蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的02.-能将NBT还原为蓝色的甲踪，甲腺在560nm波长有最大吸收，而SOD能清除02.-抑制甲腺的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对02.-的抑制率，可

4、以表征出SOD含量。三•实验材料和主要仪器实验材料：叶龄差异明显的叶片若干主要仪器：分光光度计，天平，离心机等四、实验方法和步骤①可溶性蛋白测定（1）制备蛋白提取液称叶龄差异明显的叶片各0.50g,加入5ml磷酸缓冲液（50mmol,pH值为7.8）,于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g离心力作用下（4°C）离心lOmin,其上清液即为蛋口提取液。（2）蛋白标准曲线的制作蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0.15MNaCl溶液中，制成lmg/ml的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160ug/200ul牛血清蛋白的标准溶液。考马斯亮蓝G-250

5、蛋白染色试剂的配制准确吸取0.2ml各含0、40、80、120、160ug牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min,用lOmni厚的比色杯在595nm下比色读取0D值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。（3）显色反应样品的测定：取40山蛋白提取液+160皿磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min,用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取0D值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。②MDA测定取上清液1.0ml于7ml离心管中，加TBA与TCA混合液4.0m

6、l,然后在离心管盖上戳一小孔,92°C水浴保温30min空白管：lmLPi-buffer+TBA与TCA混合液4.0ml（92°C水浴30min）冷却后，平衡，离心5min;lOOOOrpm测定A532,A450和A600③超氧物岐化酶（SOD）活性测定称叶龄差异明显的叶片各1.0g,加入5ml磷酸缓冲液（50mniol,pH值为7.8）,于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下（4C）离心10min,其上清液即为酶提取液。在暗光条件下加入3mLNBT反应液和100uL酶提取液于试管中，在25°C照光（4000-100001ux）并计时,6-25min后出现颜色变化，

7、9min后测560nm0D值。同时作空白实验。根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（imit/gFW）。一个酶活单位相当于引起3mL曲T反应液达到50%抑制所需要的酶量。测定时用未照光NBT反应液调零。五、实验数据记录和处理①可溶性蛋白测定标准曲线171.42x-2.4537R2二0.9955显色反应:叶片种类0D新叶0.183老叶0.109在标准曲线上查得新叶蛋白质量为28.916ug,老叶为16.231ug可溶性蛋白含量(Fig/g.FW)=标進曲线上查得的蛋白质量(卩g)