原生质体融合技术简介.ppt

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1、原生质体融合一原生质体融合二原生质体融合的特点三原生质体融合的过程四原生质体融合的应用一原生质体融合定义：原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发生两次基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。一原生质体融合原理：两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下，两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重

2、组体，达到基因重组的目的，最后对重组体进行生产性能，生理生化和遗传特性分析。二原生质体融合的特点1杂交频率较高由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。2受接合型或致育性的限制较小由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制就比较小。3重组体种类较多由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的

3、重组体4遗传物质的传递更为完整由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此，遗传物质的交换更为完整。原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到—起。5可以获得性状优良的重组体可以与其他的育种方法相结合，将从其他方法获得的优良性状，通过原生质体融合再组合到一个单菌株中。6可以提高育种（筛选）效率采用温度、药物或紫外线照射等处理钝化一方亲株的原生质体，然后再与另一亲株的原生质体融合，因此就可以在筛选过程中除去一方亲株，从而提高筛选效率。7有可能采用产量性状较高的茵株作为融合亲株由于遗传标记如营养缺陷型往往影响工业微生物的某些生物合

4、成能力，而进行一般基因重组时又必须采用较多的遗传标记，因此，势必使出发菌株的生产性能下降而影响杂交子代的生产水平。但由于原生质体融合频率较高．所以采用较少标记或不带标记的菌株进行融合．这对改良生产菌株性能来说非常有效。8有助于建立工业微生物的转化体系三原生质体融合的过程亲株甲乙原生质体融合体酶解融合再生再生筛选优化遗传标记亲株筛选原生质体制备原生质体再生及再生频率计算原生质体的融合异核体检出重组体检出和鉴定重组体的形态，生理生化和遗传分析1标记菌株的筛选用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为标记，也可以采用热致死，孢

5、子颜色，菌落形态作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷性菌株2原生质体的制备获得有活力、去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种技术的先决条件。在细菌和放线菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；制备葡萄球菌的原生质体，则需用溶葡萄球菌素处理；制备酵母菌的原生质体时，一般可用蜗牛酶；制备丝状真菌的原生质体时，可用蜗牛

6、酶，在丝状真菌的原生质体制备中很少单独使用一种酶，而是采用两种或三种酶混合处理。另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是菌体的性质，酶的性质以及反应环境(1)菌体的前处理为了使酶的作用效果更好一些，可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。(2)菌体的培养时间微生物能否较好地形成原生质体与微生物的生理状态有一定的关系。为了使菌体细胞易于原生质体比，一

7、般选择对数生长期的菌体。这时的细胞正在生长，代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。由其得到的原生质体，形成率高，再生率也很高。(1)酶浓度对于不同种属的微生物来说．不仅对酶的种类要求不同，就是酶的浓度也有差异。一般地说，酶浓度增加，原生质体的形成率也增加，超过一定范围．则原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。因此，有人建议以使原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度。(2)酶解温度据报道酶解温度对原生质体再生的影响很大。因此，在选择最佳酶解温度时．除了要考虑酶的最适温度外，还要用原

8、生质体再生率加以校正(3