DNA电泳及应用技术.ppt

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1、DNA电泳及应用技术找答案……基因操作中常用电泳有哪些？差别在哪里？影响凝胶电泳的因素有哪些？聚丙烯酰胺凝胶是怎么样构成的？电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。概述凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。特点：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。2.电泳操作方法简便，电泳速度快3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。4.适用于生化，免疫等定性定量测定琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin）琼脂糖半

2、乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶的特点（一）优点1.分离范围广，约200bp——50kb的核酸均可。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性（二）缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与聚丙烯酰胺电泳相比，分辨率低。影响核酸凝胶电泳的因素：1．样品核酸的性质2．电

3、场强度和电场方向3．电泳环境：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率4．凝胶孔径的大小。什么是迁移率带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度影响因素有：1、DNA的分子大小线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2、琼脂糖浓度DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围3、DNA分子的构象相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度超螺旋DNA最快,而开环双链DNA移动最慢。4、电源电

4、压在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。随着电场强度的增加，片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。5、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶（EB）用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间，使线状DNA迁移率降低15％。常用染料EB:溴化乙锭，能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的D

5、NA即可检出；可以加到样品中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。Genefinder:新型低毒，高灵敏度染料，加入样胶中，价格较低。6、离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。常用的电泳缓冲液一般配制成浓缩母液,储于4℃保存备用.实验步骤⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。

6、（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并摇匀。）⑵用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。⑶充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔⑸打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。。⑹将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩

7、，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法1.）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2.）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。3.）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。4.）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳