全血DNA的提取及电泳.ppt

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1、DNA的提取及电泳2013.03.30生物化学与分子生物学1.实验原理DNA一、全血DNA的提取由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相分离。通过SDS的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。最后用乙醇沉淀洗出DNA。2.材料与方法⑴.材料用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应。每5ml的血液中加入0.4ml0.04MEDTA配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。保存于-20

2、℃至-80℃，最好在2个月内提取。3%明胶，TES，Tris饱和酚（pH7.8），氯仿：异戊醇（24:1），无水乙醇，TE离心机，7ml离心管，1.5mlEP管，中试管，移液器⑵方法：Ⅰ提取WBC取1ml全血等体积3%明胶37℃静置，5·10min取上清3000r/min离心，5min弃上清颠倒混匀溶液颜色均一溶液颜色上下分层沉淀颜色为红色Ⅱ破碎WBC加入2mlTES加10滴10%SDS轻轻敲击管底震荡混匀颠倒混匀溶液全部变为粉红色溶液颜色变暗Ⅲ抽提DNA加等体积Tris饱和酚颠倒混匀，50次，3000rpm，离心5min取下

3、层酚溶液，混匀后溶液变为均一的棕色取上清加等体积氯仿：异戊醇（24:1）将上清移入试管颠倒混匀，50次3000rpm，离心5min混匀后溶液变为均一的乳白色上清夜（DNA）蛋白质层酚溶液上清夜（DNA）蛋白质层氯仿溶液Ⅳ沉淀DNA加2.5倍无水乙醇吸出絮状沉淀到1.5mlEP管挥干至无色液体通风橱内放置5min加入100μІddH2O溶解缓慢加入后，上下均为无色，但有分层面；吸取上层乙醇，轻轻吹打下层（油状）混匀。无水乙醇与水溶液交界面特点：1.气泡2.白色絮状沉淀二、琼脂糖凝胶电泳⑴琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定以及纯

4、化DNA或者RNA分子的方法。⑵这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。1.原理⑶电泳介质琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物。沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小（孔径范围从50nm到大于200nm）决定于琼脂糖的浓度。⑷.DNA分子的电荷效应：DNA在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。DNA带净电荷量的多少与电流强度，电泳缓冲液的pH值和离子强度有关。⑸.DNA琼

5、脂糖电泳的分子筛效应：在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小、构型和琼脂糖的浓度是主要的影响因素。①DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。M12345②③琼脂糖的浓度①示踪染料：有致癌性:EB，吖啶橙等;无毒的染料：goldviewI核酸染料等⑹.示踪染料和分子量标准参照物EBgoldview②分子量标准参照物（Marker）⑴实验材料：全血基因组总DNA⑵.实验试剂：琼脂糖5×TAE电泳缓冲液6×电泳载样缓冲液（6×loadingdye）：0.25％溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40％(

6、w/v)蔗糖水溶液，贮存于4℃。goldviewI型核酸染料：每10μlDNA加入2μl染料。3.实验材料和试剂⑶.实验仪器凝胶成像系统4.操作步骤⑴.制胶1.0%琼脂糖凝胶，0.5×TBE⑵.上样上样缓冲液⑶.电泳100V，20min⑷.观察紫外灯下观察溶胶上样准备DNA:8μl6×loadingdye:2μlTotal:10μl分别吸取上述体积的DNA和6×loadingdye，至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。凝胶冷却至50℃，加goldviewI2μl摇匀凝胶凝固后取出梳子加缓冲液准备样品点样电泳注意观察溴酚蓝染

7、液的迁移紫外灯下观察电泳结果照相制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不可太快，否则容易出现气泡。2.胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔。3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多。实验注意事项