质粒DNA的提取及电泳检测.pdf

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1、实验质粒DNA的提取及电泳检测一实验目的通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。二实验原理1.细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。2.质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3.碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。三实验材料：转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌)四、实验用具和药品1.实验用具:摇床

2、，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（1.5mL）2.实验试剂：（1）溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0）10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）（2）溶液II0.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等体积混合（3）溶液III5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml（4）TE缓冲液10mmol/LTris·HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）（5）70%乙醇（放-20℃冰箱中，用

3、后即放回）（6）加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰（7）电泳缓冲液：0.045mol/LTris-硼酸0.001mol/LEDTA（0.5XTBEbuffer）电泳缓冲液贮存液：5X：54gTris碱、27.5g硼酸、20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）五实验步骤（一）细菌繁殖挑取白色的单菌落若干，转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/mlAmp),37℃过夜振荡（200r/min）培养。（二）菌体收集将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，离心30sec5000r/min；弃上清提取质粒（

4、三）质粒提取方法一：碱裂解法提取质粒DNA1．.将上述沉淀重悬于250μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡；2．加入250μL溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5~10次；3．加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5~10次；9000r/min离心5min上清转移到另一新1.5mL离心管中；4．加等体积氯仿，振荡混合，静置，9000r/min离心5min，上清转移到另一新1.5mL离心管中；5．加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min离心5min；6．弃

5、上清，用70％ethanol洗涤；7．加30μLTE溶解，-20℃保存。方法二：试剂盒提取方法1.离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL，重悬菌体，不应留有小的菌块；2.加溶液Ⅱ250μL，轻轻颠倒离心管4-6次，使菌体充分裂解，至溶液澄清；3.加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，温和并充分地上下翻转混合6-8次；4.12000r/min离心10min；5.将上清转移到DNA结合管（置于2ml离心管中），12000r/min离心1min，弃滤液；6.将制备管置回离心管，加入去蛋白试剂500μL，12000r/m

6、in离心1min，弃滤液；7.将制备管置回离心管，加洗涤液700μL，12000r/min离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μL洗涤液洗涤一次，弃滤液。8.将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min，去除残余的洗涤液；10将DNA结合柱放入另一个新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加60-80μL洗脱液或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min。（四）检测提取DNA质量的电泳检测。取4ul质粒DNA+2ul加样缓冲液+6ulddH2O；配制1%的琼脂糖凝胶电泳30min，EB染

7、色，拍照。注意事项：氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、口罩。六实验作业1.思考本实验的关键步骤是什么？2.琼脂糖电泳鉴定质粒DNA时，能看到几条带，快慢顺序是什么？3.附上电泳图片。（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）