M13噬菌体单链DNA的提取.ppt

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1、M13噬菌体单链DNA的提取毕香梅2015.03.30M13噬菌体M13噬菌体生物结构呈丝状长管状结构，由外壳蛋白包装一条DNA（6407）链组成。M13只感染雄性（F’）大肠杆菌。不裂解宿主，从宿主中分泌出噬菌体颗粒。DNA有11个基因，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义，编码三类蛋白（复制蛋白，形态发生蛋白，结构蛋白）。M13DNA的Ori在基因间隔区内，间隔区内核苷酸序列发生改变，不影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。M13噬菌体DNAM13噬菌体的生命周期M13噬菌体单链DNA的提取在13噬菌体载体

2、中克隆常用菌株:JM101 supE D （lac-proAB）  JM105 JM101/ hsdR 4  JM107 JM101/ hsdR 17  JM109 JM101/ hsdR 17 recA1  TG1 JM101/ hsd D5（不修饰不限制）XL1-BlueM13噬菌体单链DNA的提取材料和试剂：YPT培养基X-gal/IPTG20％PEG(8000)3.75M醋酸铵溶液(pH7.5)TE缓冲液氯仿，异戊醇，苯酚，乙醇，70％乙醇7.5mol/L醋酸铵,灭菌1.5ml离心管去离子水冰浴大肠杆菌，M13噬菌斑仪器设备：恒温培养箱

3、，恒温振荡培养箱，水浴锅，高速离心机，微量移液器蓝白斑筛选。M13噬菌体转化入大肠杆菌宿主菌，在含有X-gal/IPTG的培养基上铺板之后,含有M13重组子的细胞将表现出白色的“噬菌斑”，从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。M13噬菌体单链DNA的提取步骤（1）过夜培养的大肠杆菌用3mlTYP培养基以1:100稀释。在37℃强烈震荡1h,将含有M13的噬菌斑(连同琼脂)转入该细胞培养液中。（2）37℃强烈震荡(300rpm)培养6h。（3）把培养液转入两只1.5mlep管,12000g离心5min。上清液转移到新ep管，加

4、入0.25V的含20％PEG(8000)的3.75M醋酸铵(pH7.5)溶液沉淀噬菌体。混匀后置冰上30min。（4）以12000g离心15min,倾去上清；再以同样方法离心一次,将PEG吸干。（5）将沉淀物重溶于400μlTE缓冲液中。（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液,震荡1min，12000g离心5min。M13噬菌体单链DNA的提取（7）将水相转入一新的ep管，加等V苯酚/氯仿(1:1)混合液,强烈振荡1min,12000g离心5min。（8）将上层水相转入另一新的ep管,重复步骤7。（9）将上层水相转入一新的ep管,加V氯仿,强烈振

5、荡1min后,12000g离心5min,重复此步骤。（10）将上层水相转入新的ep管,加0.5倍体积的7.5mol/L醋酸铵,2倍体积乙醇,混匀后-20℃放置30min。（11）12000g离心10min,去除上清,用70％乙醇小心清洗沉淀,倾去酒精,干燥沉淀物。（12）将DNA的沉淀物溶解于20μl去离子水中，进行琼脂糖凝胶电泳检测。谢谢！欢迎各位老师批评指正！