单条线虫dna提取方法

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1、2011年第2期植物检疫PLANTQUARANTINE单条线虫DNA提取方法Vol．25No．2王江岭1张建成2顾建锋1*（1．宁波出入境检验检疫局技术中心浙江宁波315012；2．嘉兴出入境检验检疫局）MethodofextractDNAfromasinglenematode．WangJiangling1，ZhangJiancheng2，GuJianfeng1*（1．Ning-boEntry－exitInspectionandQuarantineBureau，Ningbo315012，China；2．

2、JiaxingEntry－exitInspectionandQuarantineBureau）AbstractTherearemanyproblemsinextractingDNAfromlargenumberofnematodes．Thenematodescouldbeamixedspecie．TheextractedDNAweredecreasinginexperimentprocess．Amplificationmightbecumberedbyaddingmoresolutes，andeventoeffect

3、onthenextexperiments．Inthismethodasinglenematodewasfreezedbyliquidnitrogenandheatedat85℃todisruptethestructureofnematodecellsbychangingthetemperaturesudden-ly．ThentheproteinsweredissolvedeasilybyproteinaseKandmoreDNAwereextracted．Thismethodwasprovedeffective，rap

4、id，andstabilebykindsofnematodes．Theadvantagesofthismethodare：（1）PCRBufferattachedtoTaqenzymetaketheplaceofWLBandSDSlysisliquids，whichreducestheinstabilityofreactionsys-temandtheeffectofaddedsolutes．（2）AlltheprocessisfinishedinonePCRtube，noliquidtransportedandles

5、ssolutesadded．SothepollutionandbadeffecttothelaterPCRprocessaregreatlyreduced．（3）Manualdis-ruptionofnematodeisreplacedbypoikilothermictreatment；pollutionisavoidedandnoexperimenttechniqueisrequired．ComparedwithtwootherproteinaseKmethodsofnematodeDNAextraction，thi

6、smethodwasprovedef-fectiveandstabile，andcouldbeusedinrapidtest；nematodeproteinsweredissolvedcompletelyandmoreDNAreleased，thePCRresultisgoodevenwhentheextractedDNAweredilutedfor32time，whichprocidesmoremo-lecularexperimentschances．Keywords摘要nematode；optimizedmeth

7、od；DNAextraction；proteinaseK；temperature大量线虫DNA的提取可能因线虫不纯而受到污染，溶液多次转移造成DNA损失，并且在提取过程中加入过多的溶质离子也可能对PCR扩增有干扰，从而影响下一步的研究。本研究用液氮快速冷冻单条线虫，继以85℃快速变温，用温度的剧烈变化使线虫裂解，再以蛋白酶K降解蛋白质，提高了获得的DNA的纯度和数量。通过多种线虫的验证试验表明，该方法高效、快速、稳定。该试验方法有如下优点：（1）使用Taq酶附带的PCRBuffer代替WLB裂解液和SDS裂解液，减少了

8、配置的不确定性和外来离子的影响。（2）整个提取过程在一个PCR管中完成，并可直接用于PCR扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添加，减少污染和对后续PCR的影响。（3）使用变温处理代替其他手工破碎方法，减少了外界污染物的掺入，不需要手工操作技巧。与另外2种提取线虫DNA的蛋白酶K方法相比，本研究提取单条线虫DNA的时间短，效率高，PC