课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

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专题2:微生物的培养与应用课题二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 课题背景1.尿素的利用:尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。2.细菌利用尿素的原因：CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3细菌脲酶课题目标1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌尿素分子的立体结构 一、研究思路（一）筛选菌株1.实例：PCR技术(DNA多聚酶链式反应)：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。提出的问题—如何寻找耐高温的DNA聚合酶？解决问题的思路—寻找耐高温环境。原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2.实验室微生物的筛选原理：选择培养基人为提供有利于目的菌株生长的特定条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 课堂探究：1、伊红美蓝培养基为什么是鉴别培养基而不是选择培养基？2、发生石油泄漏后，一些微生物可以有效的分解石油，如何配置选择培养基将这些微生物选择出来？ 二、实验设计土壤取样样品稀释土壤微生物大约70%-90%是，细菌在酸碱度接近___的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层，因此取样时一定要铲__________。细菌中性去土表层所选用的样品稀释范围要保证获得菌落数在之间，适合计数。细菌选用：、、倍的稀释液进行平板培养；放线菌选用：、、倍的稀释液进行平板培养；真菌选用：、、倍的稀释液进行平板培养；30-300一万十万百万一百一千一千一万一万十万 制备培养基微生物培养注：不同的微生物需要不同的培养温度和时间微生物观察观察菌落：细菌合成的将尿素分解成，使培养基的__增强，在以为唯一氮源的培养基中加入_指示剂培养细菌，若指示剂变，可确定该种细菌是能够______的微生物，即目的微生物。计数菌落：每隔24h统计数一次，最后选取数目时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落数。脲酶碱性尿素氨红酚红分解尿素菌落稳定牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。选用稀释倍数为103~107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备几个牛肉膏蛋白胨培养基和几个选择培养基？准备好无菌试管和移液管 碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。3.选择培养基问题3：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？问题4：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。加入青霉素的培养基概念：—细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。不加含碳有机物的无碳培养基—分离自养型微生物。对应课堂探究3和4题 5、两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。稀释涂布平板法计算注意事项： 学案预习（二）1、2（二）统计菌落数目 2.间接计数（活菌计数法）C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mＬ)，M代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法。（1）常用方法：计算公式：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M【例7】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（）A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4（3）计数B（二）统计菌落数目【解析】稀释倍数为106，0.1mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。 微生物的培养、观察并记录结果 (一)无菌操作1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。(二）做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。（三）规划时间三、操作提示 【课堂小结】一、选择培养基的成分：分解尿素细菌的分离与计数尿素作为唯一的氮源。二、鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。三、统计菌落数目的方法（1）间接计数法①计算公式每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M②操作：设置重复组，选择菌落数30～300的平板进行计数。（3）设置对照①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。②证明选择培养基的选择作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。