PCR-DGGE技术.ppt

《PCR-DGGE技术.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳PCR-DGGE（PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis)汇报人：学号：环境微生物新技术目录（一）DGGE的简介（二）DGGE的定义（三）DGGE的基本原理（四）PCR-DGGE的操作流程（五）DGGE的优缺点（六）DGGE的应用变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE)最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muy

2、zer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。一、DGGE简介DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的D

3、NA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。二、DGGE的定义使用对象：长度相同但序列不同的DNA片段变性剂：尿素和甲酰胺DGGE不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。

4、原理：根据DNA的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。三、DGGE的基本原理DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值取决于DNA分子中G-

5、C含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60℃，变性剂0~100%。DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使实验无法检出存在于高TmDNA片段中的碱基替换。为了解决此问题。可以在一个PCR引物的5'端设计一段富含G-C的尾巴，从而使扩增产物富含G-C碱基对（30~40bp),保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE的突变检出率接近100%。三、

6、DGGE的基本原理根据变性剂梯度方向的不同,DGGE可分为:垂直DGGE和平行DGGE（1）垂直DGGE，变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;（2）平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测DGGE的分类环境样品基因组DNA的提取目标片段的PCR扩增DGGE图谱的分析图像的采集和条带的回收DGGE分析电泳前准备工作电泳分析剥胶、染色DGGE条带测序四、PCR-DGGE分析微生物群落的主要步骤总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的D

7、NA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性③制备DNA花费时间的长短。关于DNA提取的建议：优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产品）。1环境样品基因组DNA的提取选择适合的目标片段，设计合适的引物，注意有GC夹子情况下引物二聚体的行程。环境样品目标片段的扩增最好采用TouchdownPCR。注意PCR的环境，V3区产物扩增极易污染。2目标片段的PCR扩增DGGE的操作流

8、程主要有：制胶点样电泳显色成像分析3DGGE分析（1）DGGE前的准备工作从这一步开始，带上手套。1.配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。2.制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防