pcr-dgge技术

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1、PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最早是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。该技术被广泛用于微生物分+生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。双链DNA分+在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的D

2、NA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（鉍素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度吋，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。不同的双链DNA片段W为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链

3、区域的解链浓度也是不一样的。当进行DGGE电泳吋，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，W此它们会在胶中不同的位置分开。然而，一h/变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DN

4、A分+，此吋他们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开來。在DNA片段的一端加入一段富含GC片段可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链变性剂浓度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加入0（3夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能区分幵來。二、实验步骤1.样品预处理2.样品DNA的提取及纯化提取方法根据各样品特点自主选择。3.PCR扩增TouchdownPCRmethod用于DGGE的PCR引物及Jt•扩增程序：(1)V3区的DGGE

5、引物200bp左右的片段正向引物：341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)；5'GC-clamp,冇利于检测发生于高熔点区的突变.反向引物：PCR程序:94°C94°C65°C72°C5min(Taqadded)lmin518R(59-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3?)PCR条件：lOxPCRbuffer2.5ulMgCl2(25mmol/L)2.5uldNTP(10mM/L)0.5ulforward-pri(lOpmol/ul)0.5ulrevers

6、e-pri(lOpmol/ul)0.5ulTemplateDNA1-2uladdddH2Oto25ullminlmin>20cycles之后每两个循环降低复性温度rc94°C55°C72°C94°C55°C72°C72°Clminlminlminlminlmin>lmin7min10cycles(2)V3〜〃5区的DGGE弓

7、物高于500bp的片段©Bacterial正向引物341—357:341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)；反向引物907—926:907R

8、(5’CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-39)PCR程序：94°C5min(Taqadded)94°ClminA65°Clmin72°Clmin20cycles之后每两个循环降低复性温度rc94°Clmin^55°Clmin>12cycles72°C3min_72°C7min②Archara正向引物344—363:ARC344F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3’)反向引物915-934:ARC915R(5,-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-