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1、形态学试验常用试剂配置方法4%多聚甲加热至60°C,搅拌并加入IMNaOH数滴，调pH至7.0,滤纸过滤，现配现用。0.01MPBS缓冲液氯化钠(NaCl)8.50g磷酸氢二钠(Na2HPO4-12H2O)3.58g磷酸二氢钠(NaH2PO4-2H2O)0.39g加双蒸水至1000ml多聚甲醛4g,加蒸帼水100ml,lMNaOH调整pH至7.2-7.4,室温存放。一袋独立包装的PBS(2000ml)加2000ml蒸馆水溶解。O.()lmol/L枸椽酸缓冲液柠檬酸0.2g柠檬酸三钠1.5g加双熬水至500mllMNaOH调整pH至6.0,现用现配。锯矶明胶液铝矶0
2、.5g明胶5g蒸憾水1000ml以500-800ml蒸馆水加温溶解明胶，待其完全溶解后加入賂矶，最后加蒸镭水至lOOOmh载玻片事先以酸、碱洗涤剂洗净，蒸憎水洗，烤干，包被时水温不超过70°C。DAB试剂的配制(以中杉公司的浓缩型DAB试剂盒为例)在1.5mlEP管内加入1-1.5ml蒸馅水,加入一滴试剂A,混合均匀，然后将试剂B和试剂C各一滴加入其中，再次混匀。此溶液必须现配现用，配好后避光保存，3()分钟内使用，剩余的液体应弃去。石蜡切片的制备1.组织块从固定液中取岀，流水冲洗l・2h2.脱水：70%酒精一80%酒精一95%酒精I->95%酒精II-无水酒精I
3、-无水酒精II,各级酒精浸泡30min-lho3.透明：彻底脱水后的组织经苯I-苯II,各浸泡30mim-lho4.浸蜡：完全透明的组织放入56-58°C石蜡中2-3ho5.包埋：被切面向下包埋于石蜡中，冷却后成蜡块。6.切片：旋转式切片机将蜡块切成5-lOgm薄片，贴在经锯矶明胶处理的载玻片上。7.58-60°C烤片24小时。冰冻切片的制备1.组织块从固定液中取出或者是刚刚取材的新鲜标本放入20%的蔗糖溶液中直至标本沉底（大约需要12-20/M）;2.0.01MPBS缓冲液冲洗,5min；3.放入冰冻切片机内进行冰冻固定4.待组织快固定好后行连续冰冻切片，片厚5
4、・20卩m,放入・2（TC冰箱内保存。免疫组织化学染色步骤1・将石蜡切片二甲苯脱蜡(二甲苯I20minf二甲苯IIl()min)>入水(10()%酒精I5min-100%洒精Il3min->95%酒精2min~>80%洒精lmin->70%酒精lmin),蒸懾水冲洗后，0.0IMPBS冲洗，5minx3次；2.枸橡酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96°C,维持10-15min,口然冷却至室温，0.01MPBS冲洗，5minx3次；3.3%H2O2溶液,37°C,20min,以消除内源性过氧化物酶的活性,0.01MPBS冲洗,5minx3次；4.正常羊血清
5、封闭，37°C,30min；5•倾去多余血清,滴加一抗，37°C2小时或者4°C过夜，0.01MPBS冲洗,5minx3次;6.滴加二抗工作液,3TC,30min,0.0IMPBS冲洗,5minx3次;7.滴加三抗工作液，3丁C,30min,0.01MPBS冲洗,5minx3次;8.DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9.0.01MPBS终止显色；10•梯度酒精脱水(70%酒精lmin->80%酒精lmin-95%酒精Ilmin-95%酒精IIlmin—无水酒精IlOmin-^无水酒精IIlOmin),二甲苯透明(二甲苯I15minf二屮苯IIlOmin；11.
6、中性树胶封片。免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92°C-96°C,10-15min,自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭,37°C,60min；(4)倾去多余血清,滴加一抗，37°C2小时或者4°C过夜，PBS冲洗,5minx3次;(5)滴加荧光素标记的二抗,避光，37°C,60min,0.01MPBS冲洗,5minx3次;(6)防淬灭封片剂封片，4°C,避光保存。(7)荧光显微镜观察拍照。细胞免疫组化染色（培养板中染色）1・培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200卩1）固定lOmin,PBS洗2
7、次,每次5-10分钟。2.在含0.1%TritonX-100（4孔板200^1）的PBS中进行lOmin的透膜处理，PBS洗2次，每次5J0分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3.羊血清用PBS配制成4%羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200gl）30分钟。4.吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37°C条件下孵育lh或放在4°C冰箱过夜，PBS洗3次，每次5・10分钟。5.去除一抗后，细胞用PBS洗三次。6.力FI入二抗，然后加入相对应的孔，在37°C下作用30-60minoPBS洗3次，每次5・10分钟。7.吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60minoPBS洗3
8、次，每次5
