实验12 常用菌种保存技术.doc

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1、实验12常用菌种保存技术为保持细菌原有的性状和活力，通过人为方法提供一定的条件，使细菌在低温、干燥、缺氧的坏境屮，生长受到抑制、新陈代谢处于最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保存菌种的日的。保存菌种的方法有很多，如斜血保存法、液体石蜡法、干燥保存法、液氮法、冷冻真空干燥法等。这里仅介绍斜面保存法、液体石蜡法、冷冻真空干燥法。一、斜面保存法【试剂与器材】1.菌种待保存的细菌、霉菌等。2.培养基培养细菌、霉菌用斜面培养基。【操作步骤】1.将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后,用纸将管塞部分包扎好,

2、置4°C冰箱屮保藏。2.保存时间依微生物的种类各异。霉菌、放线菌及有芽胞的细菌保存2〜4个月转种一次，普通细菌最好每月转种一次，假单胞菌两周转种一次，酵母菌两个月转种一次。【评价】木法操作简单、使用方便、不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是保藏时间短、需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。二、液体石蜡法【试剂与器材】1.菌种待保存的细菌，霉菌等。2.培养基培养细菌、每菌用培养基。3.溶液或试剂液体石蜡。4.仪器或其他用具无菌吸管，40°C温箱等。【操作步骤】1.将液体石蜡分装

3、于试管或三角烧瓶屮，塞上棉塞并用牛皮纸包扎好，121°C灭菌30min,然后放在40°C温箱屮使水蒸发后备用。2.将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养，直到生长良好。3.用无菌吸管吸収无菌的液体石蜡，加入己生长良好的菌种斜血上，加入的石蜡高出斜面顶端Icm为宜,使菌种与空气隔绝。4.将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比在冰箱屮保存的时间还要K）。【评价】此法实用而且效果较好。产砲子的霉菌、放线菌、芽胞菌可保藏2年以上，有些酵母菌可保存1〜2年，一般无芽胞细菌也可保存I年左右，篡至用一般方袪很难保藏

4、的脑膜炎奈瑟菌，在35°C〜37°C温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需:特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置,所占位置较大，同时也不便携带。【注意事项】从液体石蜡下面取培养物移种后接种坏在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。三、冷冻真空干燥法【试剂与器材】1.菌种待保存的细菌、霉菌等。2.培养基培养细菌、霉菌用培养基。3.溶液或试剂95%乙醉，10%盐酸，干冰，脱脂奶粉。4.仪器或其他用具无菌吸管，无菌滴管，无菌培养川L,冻干管，真空泵、真空压力表，喷灯，普通

5、冰箱,低温冰箱C30°C）,超低温冰箱。【操作步骤】1.准备冻I•管选用中性硬质玻璃，内径约60cm〜80cm,璟厚0.6cm〜1.2cm,氏约10cm~15cm的冻干管,用10%盐酸浸泡8h〜IOh后用自來水冲洗多次，最后用蒸谓水冲洗1〜2次，烘干,将写有保存菌名、日期的标签放于冻干管内,管口加棉花。121°C灭菌30min。2.培养菌种将要保存的菌种接入斜面培养基屮，一般细菌培养24h〜48h、酵母菌72h,放线菌与真菌培养7d〜10d。3.配制保护剂将脱脂奶粉配成20%乳液，112C,灭菌25min,随机抽样进行

6、无菌检查，确认无菌后方可使用。4.制备菌悬液吸2ml〜3ml保护剂加入新鲜斜面菌种试管，用接种环将菌苔或砲子洗下振荡，制成菌悬液,宾菌菌悬液需置4°C平衡20min-30mino5.分装样品用无菌毛细滴管吸取菌怂液加入冻干管、每管装约0.2M,另外在几支冻干管屮分别装入0.2ml>0.4ml蒸懈水作对照。6.预冻干冰槽中放一小杯乙醉，将冻干管放于乙醉屮，此时温度可达-40°C〜-70°C,冷冻lh即可。有条件者，可用程序控制温度仪进行分级降温。不同的微生物其最佳降温度率有所差异，…般山室温快速降温至4°C,4C至・40

7、"C毎分钟降低1°C,・40C〜-60C以下毎分钟降低5°C。或用冰箱逐步降温，从室温至4°C至・12°C（三星级冰箱为-I°C〜8°C）至・30°C至・70°C。7.冷冻真空干燥启动冷冻真空干燥机制冷系统。当温度下降到-5（TC以F时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥。8.取出样品先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。先取几只冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散.说明干燥程度达到要求。若用力颠，样品不与内壁脱开，也不松散，则需继

8、续冷冻真空干燥，此时样品不需事先预冻。9.熔封用高频电火花真空检测仪检测冻干管内的真空程度。当检测仪将要触及冻干管时，发出蓝色电光说明管内的真空度很好，便在火焰下（氧气与煤气混合调节，或用酒精喷灯）熔封冻干管。10.检测存活性每个菌株取1支冻干管及时进行存活检测。打开冻干管,加入0.2ml无菌水,用毛细滴管吹打几次，沉淀物溶解后（