富油脂微藻的分离筛选与鉴定.doc

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1、富油脂微藻的分离筛选与鉴走•农学论文富油脂微藻的分离筛选与鉴定张翼，廖浩，赵秀云(华中农业大学生命科学技术学院，武汉430070)摘要：为从中国江河、海水等水体中筛选油脂含量较高的微藻，采集了青岛海水、武汉南湖水的水样，分离了12株微藻。对微藻的油脂含量进行了测定，其中油脂含量最高的微藻为H2・1,油脂含量达到56・25%细胞干重，其次是BQ6,油脂含量为31.43%oBQl、BQ2、BQ4、BQ6油脂含量也较高，达29%左右。PCR扩增获得微藻18SrDNA的部分片段,序列测定后，进行BLAST同源性分析。结果表明，QS1、QS

2、2、QS3、BQ1XBQ2、BQ3XBQ4、BQ5、BQ6、H2・2均属于小球藻属(Chlorellaspp.),H2属于胶网藻属(Dietyosphaeriumsp.L该研究将为中国生物能源的生产和开发提供优良的藻种资源。关键词:微藻；油脂；鉴定；小球藻；生物能源中图分类号：S968.4文献标识码:A文章编号：0439・8114(2015)03・0574・04生物能源是由活的生物体或其代谢产物产生的。第一代生物能源来自于玉米、大豆、甘蔗。第二代生物能源来源于纤维素类物质”木材废料如锯末,农业废料如玉米秆、小麦秸秆、快速生长的草和

3、木材等。第三代生物能源来自于藻类(Algae、蓝藻。藻类种类很多，包括单细胞的微藻、多细胞的大型藻类,存在于多种水体中，包括淡水、海水。微藻(包括绿藻、硅藻、蓝藻等)含有高水平的脂类,是发展生物能源的极佳生物来源。某些藻类含40%脂肪酸，这些脂肪酸能被提取并转化为生物燃料。目前已发现多种能作为生物能源的藻类，包括NeochlorisoleoabundansxScenedesmusdimorphus.Eug1enagracilis.Phaeodacty1umtricornutum.PleurochrysiscarteraexTetr

4、aselmischui、Isochrysisga1banasBotryococcusbraunii.Dunaliellatertiolecta.Ch1amydomonasreinhardtii[1,2L与陆地植物相比，藻类每单位面积可产生8~24倍生物柴油，使藻类位于生物柴油的首要地位。每公顷藻类可生产20000-100000L油脂。而玉米每公顷仅产172L油脂，大豆每公顷产446L油脂，花生每公顷可产1059L油脂。可见，藻类与目前种植的植物相比，其单位面积可产20倍及更多的油脂。且藻类生长迅速，某些藻类在一天中能繁殖1-3代。

5、微藻具有的这些优点，使其受到科研工作者的青睐。美国通过基因工程获得的小环藻,在实验室条件下，其脂质含量增加到占干重的60%以上，户外生产可达到40%以上［3・5L中国有着丰富的藻类资源，微藻无疑是制备生物柴油原料的优良替代品,具有广阔的开发前景。微藻热解所得的燃油热值高达33MJ/kgo异养培养小球藻,并优化其培养条件后，可获得57.9%的燃油，是自养培养小球藻所产生燃油的3.4倍[6L然而，从藻类生产油脂仍处在实验室阶段，或者田间试验阶段，主要是因为藻类油脂的实际产量要比理论值低90%~95%，使得藻类生物油的生产成本非常高昂。

6、本研究对中国水域中微藻进行筛选，寻找富油藻类，通过硏究其生长特性、脂肪酸成分，寻找适合作为生物柴油原料的藻类。1材料与方法11藻种微藻由本实验室从青岛海水、武汉南湖水中筛选获得，共计有12株。1・2培养基从海水中筛选微藻采用L1海水培养基培养［7］,从南湖水筛选的微藻采用BG11和TAP培养基培养［811・3微藻的培养从采集的水样中分离微藻，采用藻类培养用的人工培养基进行培养，在光照度30001x，光暗比为12h:12hz（25±1）弋温度条件下培养。每天摇动2~3次，15d后离心，收集藻泥，真空冷冻干燥，藻粉于-20°C保存备用

7、。采用超声波破碎处理细胞以提取油脂。油脂的提取参照B1igh等［9啲方法:在离心管中加入一定重量的（W）干藻粉、氯仿■甲醇（2:1）混匀，于25°C放置24ho涡旋2min,于3000r/min离心10mino在上清液中加入氯仿-甲醇混合液（2:1）,涡旋，于3000r/min离心10mino收集上清液，在70°C烘箱中烘干至恒重（W1X油脂含量二W1/Wx100%1・5微藻的分类鉴定对分离的富油微藻进行形态鉴定和分子鉴定。显微镜观察微藻的细胞形态。用CTAB法提取微藻细胞的DNA［10L取200mg培养至对数期的微藻样品置于!■

8、・5mL的离心管中，加入600pLCTAB缓冲液(2%CTAB,100mmo1/LTris-HC1,pH8.0,1.4mo1/LNaC1,10mmo1/LEDTA,2%疏基乙醇)，混匀，于65°C水浴保温1h。取出后加等体积PCI提取液(苯酚/氯仿