富油脂微藻的分离筛选与鉴定

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1、富油脂微藻的分离筛选与鉴定张翼，廖浩，赵秀云（华中农业大学生命科学技术学院，武汉４３００７０）摘要：为从中国江河、海水等水体中筛选油脂含量较高的微藻，采集了青岛海水、武汉南湖水的水样，分离了１２株微藻。对微藻的油脂含量进行了测定，其中油脂含量最高的微藻为Ｈ２－１，油脂含量达到5６．２５％细胞干重，其次是ＢＱ６，油脂含量为３１．４３％。ＢＱ１、ＢＱ２、ＢＱ４、ＢＱ６油脂含量也较高，达２９％左右。ＰＣＲ扩增获得微藻１８ＳｒＤＮＡ的部分片段，序列测定后，进行ＢＬＡＳＴ同源性分析。结果表明，ＱＳ１、ＱＳ２、ＱＳ

2、３、ＢＱ１、ＢＱ２、ＢＱ３、ＢＱ４、ＢＱ５、ＢＱ６、Ｈ１－１、Ｈ２－２均属于小球藻属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｓｐｐ．），Ｈ２－１属于胶网藻属（Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍｓｐ．）。该研究将为中国生物能源的生产和开发提供优良的藻种资源。..关键词：微藻；油脂；鉴定；小球藻；生物能源中图分类号：Ｓ９６８．４文献标识码：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）０3－0574－０4生物能源是由活的生物体或其代谢产物产生的。第一代生物能源来自于玉米、大豆、甘蔗。第二代生物能源于纤维素类物质，木材废料如锯末，农业废料如玉米

3、秆、小麦秸秆、快速生长的草和木材等。第三代生物能源来自于藻类（Ａｌｇａｅ）、蓝藻。藻类种类很多，包括单细胞的微藻、多细胞的大型藻类，存在于多种水体中，包括淡水、海水。微藻（包括绿藻、硅藻、蓝藻等）含有高水平的脂类，是发展生物能源的极佳生物。某些藻类含４０％脂肪酸，这些脂肪酸能被提取并转化为生物燃料。目前已发现多种能作为生物能源的藻类，包括Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ

4、、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓｃａｒｔｅｒａｅ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓｃｈｕｉ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓｇａｌｂａｎａ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｂｒａｕｎｉｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ［１，２］。与陆地植物相比，藻类每单位面积可产生８～２４倍生物柴油，使藻类位于生物柴油的首要地位。每公顷藻类可生产２００００～１０００００Ｌ油脂。而玉米每公顷仅产１７２Ｌ油脂，大豆每公顷产４４６Ｌ油脂，花生每公顷可产１０５９Ｌ油脂。可见，藻类与目前种植的植物相比

5、，其单位面积可产２０倍及更多的油脂。且藻类生长迅速，某些藻类在一天中能繁殖１～３代。微藻具有的这些优点，使其受到科研工的青睐。美国通过基因工程获得的小环藻，在实验室条件下，其脂质含量增加到占干重的６０％以上，户外生产可达到４０％以上［３－５］。中国有着丰富的藻类资源，微藻无疑是制备生物柴油原料的优良替代品，具有广阔的开发前景。微藻热解所得的燃油热值高达３３ＭＪ／ｋｇ。异养培养小球藻，并优化其培养条件后，可获得５７．９％的燃油，是自养培养小球藻所产生燃油的３．４倍［６］。然而，从藻类生产油脂仍处在实验室阶

6、段，或者田间试验阶段，主要是因为藻类油脂的实际产量要比理论值低90%~95%，使得藻类生物油的生产成本非常高昂。本研究对中国水域中微藻进行筛选，寻找富油藻类，通过研究其生长特性、脂肪酸成分，寻找适合作为生物柴油原料的藻类。１材料与方法１．１藻种微藻由本实验室从青岛海水、武汉南湖水中筛选获得，共计有１２株。１．２培养基从海水中筛选微藻采用Ｌ１海水培养基培养［７］，从南湖水筛选的微藻采用ＢＧ１１和ＴＡＰ培养基培养［８］。１．３微藻的培养从采集的水样中分离微藻，采用藻类培养用的人工培养基进行培养，在光照度３０

7、００ｌｘ，光暗比为１２ｈ∶１２ｈ，（２５±１）℃温度条件下培养。每天摇动２～３次，１５ｄ后离心，收集藻泥，真空冷冻干燥，藻粉于－２０℃保存备用。采用超声波破碎处理细胞以提取油脂。１．４油脂含量的测定油脂的提取参照Ｂｌｉｇｈ等［９］的方法：在离心管中加入一定重量的（Ｗ）干藻粉、氯仿－甲醇（２∶１）混匀，于２５℃放置２４ｈ。涡旋２ｍｉｎ，于３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。在上清液中加入氯仿－甲醇混合液（２∶１），涡旋，于３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。收集上清液，在７０℃烘箱中烘干至恒重（Ｗ１）。油脂含

8、量＝Ｗ１／Ｗ×１００％１．５微藻的分类鉴定对分离的富油微藻进行形态鉴定和分子鉴定。显微镜观察微藻的细胞形态。用ＣＴＡＢ法提取微藻细胞的ＤＮＡ［１０］。取２００ｍｇ培养至对数期的微藻样品置于１．５ｍＬ的离心管中，加入６００μＬＣＴＡＢ缓冲液（２％ＣＴＡＢ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，２％巯基乙醇），混匀，于６５℃水浴保温１ｈ。取出后加等体积ＰＣＩ提取液（苯酚／氯仿／异戊醇