转基因技术提高海洋富油微藻油脂含量的研究

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转基因技术提高海洋富油微藻油脂含量的研究转基因技术提高海洋富油微藻油脂含量的研究报报告告人：郑人：郑立立国家海洋局第一海洋研究所国家海洋局第一海洋研究所 FIO,SOAisacomprehensiveoceanographicresearchinstituteengagedinappliedandbasicresearches,hightechnologydevelopmentandservingthepublic.Theinstituteaimsatpromotingthemarinescienceandtechnologyprogress,servingthemarinemanagement,marinesafetyandmarineeconomydevelopment,isanimportantmarinescienceresearchentityinthenationalscience. 海洋生态研究中心分析测试平台TOF-MSHPLC-MSICP-MSGC-MS 海洋生物质能研究开发平台 生物柴油(biodiesel)是生物能源的主要形式之一，它以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和黄连木等油料林木果实、工程微藻等油料水生植物以及动物油脂、废餐饮油等为原料制成的液体燃料，是优质的石化柴油代用品。由于生物柴油具有再生性、易生物降解、无毒、不污染环境等特点，可作为一重要新能源取代或者部分替代石化柴油。 用于生产生物柴油原料的占地需求用于生产生物柴油原料的占地需求原料油产量L/ha需要用地M占目前美国农业升/公顷ha用地的百分比（%)百万公顷a玉米（4-8%）1721540846大豆（18-24%)446594326麻疯树果籽（50-60%）189214077椰子(60-65%)26899954油棕(45%)59504524a：可满足美国所有运输燃料的50%寻找合适的油脂原料（少占用农业用地、高油脂含量、可再生资源） 利用微藻生产生物能源具有以下特点利用微藻生产生物能源具有以下特点：：11、微藻能够有效地利用太阳能，通过光和作用固、微藻能够有效地利用太阳能，通过光和作用固定定COCO，将无机物转化为氢、高不饱和烷烃、油，将无机物转化为氢、高不饱和烷烃、油2脂等能源物质；脂等能源物质；由于体积小，微藻在单位面积的由于体积小，微藻在单位面积的产油脂产率是陆生产油植物的产油脂产率是陆生产油植物的3030倍，产油效率高。倍，产油效率高。 利用微藻生产生物能源具有以下特点利用微藻生产生物能源具有以下特点：：22、作为可再生资源，微藻的、作为可再生资源，微藻的环境适应能力强、环境适应能力强、生长周期短、不受气候限制，易于进行人工可生长周期短、不受气候限制，易于进行人工可控的大规模培养控的大规模培养，能量要求低，产业化投资小。，能量要求低，产业化投资小。33、微藻培养场地无特殊要求，、微藻培养场地无特殊要求，不占用农用耕不占用农用耕地，如与发电厂联合，还可消耗电厂排出的地，如与发电厂联合，还可消耗电厂排出的COCO2污染物污染物。。 用于生产生物柴油原料的占地需求用于生产生物柴油原料的占地需求原料油产量L/ha需要用地M占目前美国农业升/公顷ha用地的百分比（%)百万公顷a玉米（4-8%）1721540846大豆（18-24%)446594326麻疯树果籽（50-60%）189214077椰子(60-65%)26899954油棕(45%)59504524微藻（油含量70%，136,90021.1干重比）微藻（油含量30%，58,7004.52.5干重比）a：可满足美国所有运输燃料的50% 海洋微藻比陆地微藻所具有的优势海洋微藻比陆地微藻所具有的优势：：11、海洋微藻种类繁多，有、海洋微藻种类繁多，有40004000种之多，由于海洋种之多，由于海洋环境的多样性也造就了海洋微藻代谢途径的多样环境的多样性也造就了海洋微藻代谢途径的多样性，其中性，其中不乏高油脂含量的海洋微藻。不乏高油脂含量的海洋微藻。 海洋微藻比陆地微藻所具有的优势海洋微藻比陆地微藻所具有的优势：：22、海洋微藻可在海边盐碱地建厂培养，生长介质、海洋微藻可在海边盐碱地建厂培养，生长介质为海水，在为海水，在不占用农业地的同时还节约了淡水资不占用农业地的同时还节约了淡水资源源。。 海洋公益项目海洋公益项目：海洋微藻制备生物柴油的规模化开发利用技术研究异养化工程微藻海洋富油获得优良藻株微藻筛选海洋微藻制柴构建转基因微藻光能自养规模化培养条件构建异养发酵藻体收集工艺优化油脂提取生物柴油制备工艺及改进甲酯化工艺生物柴油精炼 一、海洋富油微藻的筛选一、海洋富油微藻的筛选海洋微藻油脂含量及脂肪酸检测技术海洋微藻油脂含量及脂肪酸检测技术通过比较不同藻细胞破碎和溶剂提取方法，确定了冻融-氯仿/甲醇法（2:1）作为微藻油脂提取方法。不同提取方法提取的4株微藻油脂含量总油脂(%DW)藻株研磨-酸热-酸热-冻融-冻融-乙醚/石油醚氯仿/甲醇乙醚/石油醚乙醚/石油醚氯仿/甲醇CCMM100127.97±2.632.43±0.615.17±0.385.3±0.238.33±1.82CCMM102215.1±1.0814.17±1.155.37±0.352.5±0.2627.7±2.01CCMM300420.6±1.325.72±0.137.37±0.46.54±0.2927.37±2.01CCMM40014.4±1.082.33±0.062.33±0.352.77±0.321.3±0.26CCMM1001:Amphidiniumsp.；CCMM2007:Skeletonemasp.;CCMM3004:Heterosigmasp.；CCMM4001:Chlorellasp.; 一、海洋富油微藻的筛选一、海洋富油微藻的筛选优化了微藻脂肪酸皂化、甲酯化的前处理过程，比较了GC-FID与GC-MS分析方法的异同，建立了一种快速检测微藻脂肪酸含量的GC-MS分析方法。条件：氦气流速为1mL/min；进样温度250℃,传输线温度为300℃；电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃；升温程序为初温50℃，保持1min，20℃/min升到190℃，4℃/min升到240℃，10℃/min升到280℃，保持2min。71.0x10小球藻C18638.0x1018000066.0x10C16561600002124.0x101762.0x10140000Abundance820320.0120000419273551015202510000071.0x10C16C18Abundance67103380000928318.0x106盐藻1113141618232934222530115246600006.0x102621Abundance64.0x104000062.0x10200005101520250.0time/min51015202535种脂肪酸甲酯标准品GC-MS色谱图时间t/mim微藻脂肪酸甲酯色谱图 一、海洋富油微藻的筛选一、海洋富油微藻的筛选高油脂含量海洋微藻的筛选高油脂含量海洋微藻的筛选9株微藻的总脂含量藻株最大密度粗油脂（105个·mL-1）(%DW)CCMM20050.5243-50CCMM500167.241-49CCMM10011.3932-40CCMM30041.527-35CCMM10080.3929-35CCMM10220.0421-30CCMM20010.6620-25CCMM10185.4619-30CCMM2005:Pseudonitzchiasp.；CCMM5001:Isochrysissp.；CCMM1001:Amphidiniumsp.;CCMM3004:Heterosigmasp.；CCMM400320.616-24CCMM1008:Alexandriumsp.;CCMM1022:Kareniamikimotoi;CCMM2001:Chaetocerossp.;CCMM1018:Prorocentrumsp.;CCMM4003Dunaliellasp. 一、海洋富油微藻的筛选一、海洋富油微藻的筛选高油脂产率海洋微藻的确定高油脂产率海洋微藻的确定考察了CCMM1001、CCMM5001、CCMM3004和CCMM1018等4株富油微藻的生长天数、生物量和粗脂含量，对其油脂产率进行分析，发现微藻CCMM5001的油脂产率最高，达到9.70mg.d-1.L-1。主要富油微藻的生长参数及油脂产率StrainsCCMM1001CCMM5001CCMM3004CCMM1018ParameterGrowthcycle(d)14132424Densityatharvest(cells·mL-1)1.39×1055.22×1061.5×1053.98×105Weightatharvest(mg·L-1)290280510680Contentoflipid(%)36.7453519.5Yieldoflipid(mg·d-1·L-1)7.609.707.448.36 一、海洋富油微藻的筛选一、海洋富油微藻的筛选主要富油微藻的脂肪酸成分分析主要富油微藻的脂肪酸成分分析4株富油微藻的主要脂肪酸组成（%）藻株CCMMCCMMCCMMCCMM脂肪酸1001500130041018C4.958.865.063.7414:0C16:029.6427.2543.7446.86C16:1(n-7)0.262.213.68－C9.5222.1933.1245.3918:0C27.2027.777.634.0218:1(n-9)C18:2(n-6)1.915.844.09－C20:00.52－－－C20:1(n-9)0.11－－－C20:5(n-3)（EPA）24.955.882.68－C22:6(n-3)0.95－－－C16-C1868.5385.2792.2796.26 一、海洋富油微藻的筛选一、海洋富油微藻的筛选从油脂含量、油脂产率及脂肪酸组成等三方面综合分析，确定金藻Isochrysissp.CCMM5001为研究目标。LLChLChLLLL 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建转基因工程金藻构建的基本原理乙酰辅酶A羧化酶增强表达ACCase是脂肪酸生物合成途径的关键限速酶,ACCase的相对活性影响着脂类代谢途径的走向,即:丙酮酸合成后,ACCase催化底物乙酸辅酶A进入脂肪酸合成途径 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建方法流程图方法流程图转基因微藻筛选用抗生素的确定PCR检测建立电转化体系激光共聚焦检测电转化克隆大肠杆菌构建金藻金藻ACCD表达载体PCR检测油脂测定富油转基因金藻ACCD：乙酰辅酶a羧化酶基因D亚基 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建富油金藻Isochrysissp.CCMM5001转基因抗生素的筛选考察了五种常见抗生素：G418、潮霉素、卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素，胁迫环境下金藻Isochrysissp.CCMM5001的生长情况，氯霉素、G418在较低浓度下可以很好的抑制其生长，但由于氯霉素的溶剂乙醇对金藻有伤害作用，不适宜用作筛选标记，所以选择G418作为基因工程的选择标记 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建富油金藻Isochrysissp.CCMM5001电转化体系的建立金藻最佳电转化条件电转化因子条件藻种状态对数生长期前期蔗糖浓度0.5moL/L冰浴时间10min电压1.6KV/cm脉冲时间5ms电转化过程主要因素对金藻存活率的影响 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建电转化方法的验证报告基因gfp（greenfluorescentprotein，绿色荧光蛋白） 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建电转化体系方法的检测（激光共聚焦检测gfp基因）未转化GFP转化后GFP转化后利用激光共聚焦检测GFP在等鞭金藻内的表达（绿色为GFP发出的荧光） 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建电转化体系方法的验证（PCR检测gfp基因）gfp基因M:Marker1:野生型金藻，2:质粒，3～6:转化第10、20、30、60天金藻 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建ACCD基因的克隆及转化金藻Isochrysissp.CCMM5001的研究大肠杆菌ACCD全长915bp,编码304个氨基酸利用固体培养基进行转化藻株的筛选 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建PCR检测结果脂肪酸组成未转基因转基因微藻C9.5519.314:0C—0.0814:1C—0.3315:0未转基因转基因微藻C22.1622.0816:0粗油脂%43±254±3C5.014.3316:1C8.830.5718:0富油工程金藻Isochrysis.C26.4340.918:1spCCMM5001-ACCDC2.045.2618:2ACCD基因C—0.4418:3C—0.4719:0C2.24—20:4C2.15—20:5C—0.5822:0C9.64—22:1C—5.3622:61、Marker；2、未转基因的藻株；3、转基因的藻株C~C含量64.4773.581618 二、转基因海洋富油金藻的构建二、转基因海洋富油金藻的构建转基因金藻遗传稳定性研究PCR检测结果ACCD基因M、Marker；1、未转基因的藻株；2~6、为转基因金藻转种2、4、6、8代藻株 致致谢谢！！中国科学院海洋研究所韩笑天副研究员孙珊硕士中国海洋大学朱明壮副教授国家海洋局第一海洋研究所郑明刚博士杨佰娟博士 欢迎指导批评欢迎指导批评