对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析.ppt

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1、实验103对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析103.1实验目的(1)了解高效液相色谱仪构造。(2)了解高效液相色谱分析操作。(3)学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量方法。103.2实验原理对羟基苯甲酸酯类混合物中含有强极性化合物对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类备组分的保

2、留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析法相同。而对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相近的校正因子，可用下式：103.3实验条件溶液的配制(1)标准贮备液：(2)标准操作液：(3)未知样品四只100mL容量瓶配制浓度均为1000μg·mL-1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液上述四种标准贮备液四只10mL容量瓶配制浓度均为10μg·mL-1的四种酯类化合物的甲醇溶液混匀备用色谱条件：(1)色谱柱(2)流动相

3、(3)检测器(4)记录仪(5)进样量长25cm、内径3mm装填C-18烷基键合相粒度为10μm的固定相甲醇︰水=55︰45流量1mL·min-1紫外光度检测器检测波长254nm量程5mV走纸速度480mm/h3μL103.4实验步骤配制好的流动相甲醇水溶液1.超声波发生器脱气15min置于仪器根据实验条件按照仪器的操作步骤2.调节至进样状态待仪器达到平衡时记录仪基线呈直线即可进样3.记录各色谱图依次分别吸取3μL的四种标准操作液和未知试液进样103.5实验数据记录与处理1．记录实验条件2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物标准溶液色谱

4、峰的保留时间tR，并填于下表中：组分名称保留时间tR/min3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：出峰顺序组分峰高h/mm半峰宽Y1/2/mm峰面积A含量wi%103.6注意事项（1）严格按照规定使用仪器，防止因错误操作造成仪器损坏。（2）流动相使用前应用微滤膜过滤并充分脱气。（3）样品溶液若不清澈透明，应用微滤膜过滤。（4）实验结束后，应冲洗色谱柱30min以上。103.7问题讨论（1）色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校

5、正因子?（2）本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。（3）高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？103.8参考答案（1）色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校正因子?答：归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件如进样量、流速等变化时，对结果影响小。但若试样中的组分不能全部出峰，则不能应用此法。本实验样品为同系物，若各组分的相对校正因子值相近，所以可以略去。（2）本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。答：流动相极性大于固定相极性的色谱称为反相色谱，反之称为正相色谱。本实验

6、所用样品均为极性化合物，依据“相似相溶”原则，宜选用极性固定相、非极性的流动相，即选择正相色谱。但是，高效液相色谱的可贵之处是它的分离效能很高，对于极性化合物往往用反相色谱也能实现很好的分离，而且，反相色谱的流动相通常使用甲醇和水，价格远低于正相色谱通常使用的正己烷。（3）高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？答：流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作；另外，如果在检测器中产生气泡，会造成基线波动或异常出峰。