对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析

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1、对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析(1)了解高效液相色谱仪构造(2)了解高效液相色谱分析操作(3)学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量方法II.实验用品仪器：高效液相色谱仪；紫外光度检测器；记录仪；10UL微量进样器；超声波发生器。试剂：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对轻基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁醋等，均为分析纯；甲醇(分析纯)；二次蒸馏水。III.实验原理在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非

2、极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与己知纯酯类备组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源己知，且组分简单的混合物。本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析法相同：i?l对羟基苯甲酸酸类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相同的校正因子，故上式可简化为：Awi?ni?100%Aii?l?II.实验条

3、件溶液的配制：(1)标准贮备液：分别于四只100mL容量瓶中，配制浓度均为1000Ug•mL-1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液。(2)标准操作液：用上述四种标准贮备液分别于四只10mL容量瓶中，配制浓度均为10Ug-mL-1的四种酯类化合物的甲醇溶液，混匀备用。(3)未知样品色谱条件：⑴色谱柱长25cm、内径3mm,装填C-18烷基键合相，粒度为10um的固定相。(2)流动相甲醇：水=55:45，流量lmL*min-l。⑶检测器紫外光度检测器，检测波长254nm。(4)记录仪量程5mV，走纸速度480mm/h。(5)进样量3uLoIII.

4、实验步骤1.将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上脱气15min。2.根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤，调节至进样状态，待仪器达到平衡时，记录仪基线呈直线，即可进样。1.依次分别吸取3UL的四种标准操作液和未知试液进样，记录各色谱图。II.实验结果1.记录实验条件。231/2A及其含量w，并将数据列于下表中：注：若使用色谱工作站，请按照相应操作步骤进行。III.问题讨论1.色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校正因子？2.木实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。3.高效液相色谱分析的流动相为何

5、要脱气，不脱气对实验有何妨碍？实验导航•导学导航：•导教导航(ppt):•答疑教师：问题解答：1.归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件如进样量、流速等变化时，对结果影响小。但若试样中的组分不能全部出峰，则不能应用此法。本实验样品为同系物，若各组分的相对校正因子值相近，所以可以略去。2.流动相极性大于固定相极性的色谱称为反相色谱，反之称为正相色谱。本实验所用样品均为极性化合物，依据“相似相溶”原则，宜选用极性固定相、非极性的流动相，即选择正相色谱。但是，高效液相色谱的可贵之处是它的分离效能很高，对于极性化合物往往用反相色谱也能实现很好的

6、分离，而且，反相色谱色谱的流动相通常使用甲醇和水，价格远低于正相色谱通常使用的正己烷。1.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作；另外，如果在检测器中产生气泡，会造成基线波动或异常出峰。