HNF1A和FOXA2过表达诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为肝样细胞的研究.pdf

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1、OVEREXPRESSIONOFTRANSCRIPTIONFACTORHNF1AANDFOXA2INDUCEDRATBONEMESENCHYMALSTEMCELLSINTOHEPATOCYTESADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByDingyiSupervisor:Prof.Dr.XuCunshuanDr.FanJinyuMay,2016摘要近年来研究人

2、员发现骨髓间充质干细胞具有自我更新、高度可塑、免疫调节的性质，在体外易于分离和扩大培养，外源基因容易在细胞内导入和表达，具有跨胚层、向多种细胞分化的潜能等特点。其中诱导其分化为肝样细胞越来越受到国内外学者的关注，间充质干细胞诱导分化得到的肝样细胞为肝病治疗以及药物筛选提供了新的种子细胞。本研究选用FOXA2和HNF1A作诱导基因，通过慢病毒介导的方法将FOXA2和HNF1A同时在BMSCs中过表达。发现从侵染后第5天起，细胞形态发生变化，挑选出红色荧光蛋白表达、细胞形态有变化、长成集落的细胞团。然后通过筛选得到两个外源基因都稳定表达的细胞克隆，通过RT-PCR检测表明，上述细

3、胞中肝细胞标记基因FOXA3、HNF4A、AFP、ALB、TAT、TTR、G6P、CYP1A1和CYP2B1等的转录产物呈阳性，而对照组BMSCs呈阴性；诱导后细胞的干性基因OCT4和NANOG表达呈阴性。细胞免疫荧光检测表明，上述诱导细胞表达AFP、ALB、G6P、CK18、TTR和TAT等肝细胞标记蛋白。Westernblot检测表明，上述细胞的肝细胞相关蛋白ALB、G6P、TAT、TTR、CK18、AFP等特异性显色，而对照细胞BM-MSCs呈阴性。综上检测结果表明，被FOXA2和HNF1A过表达诱导的BMSCs具有肝细胞的分子特征。为了进一步验证诱导细胞的功能，本论文

4、又采用PAS糖原染色、ICG摄入检测和油红O脂肪染色等方法来检测诱导细胞是否具有肝细胞的功能。结果表明，与对照组BMSCs相比，诱导细胞具有与类似肝细胞糖原储存能力、ICG代谢能力和脂肪储存能力。此结果进一步说明了FOXA2和HNF1A过表达能诱导BMSCs分化为肝样细胞。综上所述，本实验成功地通过一对新的转录因子组合定向诱导骨髓间充质干细胞分化成肝样细胞，同时还具有节省诱导时间和诱导效率较高等优点。关键词：骨髓间充质干细胞，叉头框蛋白A2(FOXA2)，肝细胞核因子1(HNF1A)，细胞定向分化，肝样细胞IABSTRACTInrecentyears,researchersh

5、avefoundthatmesenchymalstemcells(MSCs)canbeinducedtoavarietyofcellsacrossgermlayer.TheinductionofMSCstohepatocyte-likehasbeenreceivedspecialattentionbyresearchers,what’smore,thisresearchprovidesanewkindofseedcellsforthetreatmentofliverdiseaseanddrugscreening.Especially,bonemarrowmesenchymal

6、stemcell(BMSCs)havecharacteristicsofself-renewal,highlymalleableandimmunomodulatory.Inaddition,theisolationandcultureofBMSCsinvitroissimple,exogenousgenecanbetransferredandexpressinBMSCseasily.Italsohasthepotentialcapabilitytobeinducedtoavarietyofcellscrossgermlayer.FOXA2andHNF1Aareimportan

7、tmembersofthehepatocytenuclearfactor(HNF)family,theyareabundantlyexpressedintheliver,andplayanimportantroleinthedifferentiationandfunctionofthelivercells.Basedonthesestudies,wehypothesizedthatFOXA2andHNF1AcoulddirectlyinduceBMSCstofunctionalhepatocytes.F