丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定【.doc

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1、临床医学论文•丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定作者：刘敏，张伟，陈天艳，蔺淑梅，赵良，刘锦锋，赵英仁，张树林【关键词】丙型肝炎病毒核心蛋白摘要：目的用含丙型肝炎病毒核心(HCVcore)蛋白的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体，并进行人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定。方法PCR扩增含HCVcore蛋白不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体PGBKT7中。扩增人胎肝cDNA文库并纯化、鉴定。结果获得含HCVcore蛋白

2、的cDNA片段，并成功克隆入pGBKT7中。待转化的人肝cDNA文库滴度在5x108左右，纯化后的质粒DNA质量浓度约lg/L。用EcoRI、XhoI双酶切显示插入片段大小不一。结论成功构建了核心蛋白的酵母双杂交诱饵载体；扩增、纯化的人胎肝cDNA文库的多样性很好，适合于筛选。为用酵母双杂交技术硏究与HCVcore蛋白相互作用的蛋白打下坚实基础。关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白；酵母双杂交；cDNA文库ABSTRACT:ObjectiveToconstructthebaitvectorofHCVcoreregioninyeas

3、ttwohybridsystem,andtoamplify,purifyandevaluatethecDNAgenebankofhumanfetalliver・MethodsThecDNAfragmentsencodingHCVcoreregionwereamplificdbyPCR,andthenwereclonedintopUC19・Afterbeingverifiedbysequencing,theyweresubclonedintothebaitvectorpGBKT7ofyeasttwohybridsystem,

4、subsequentlyamplificdandpurified・AndthentheeDNAgenebankofhumanfetal1iverwasevaluated.ResultsThecDNAfragmentsofHCVcoreregionwereamplifiedsuccessfully.ThecDNAgenebankofhumanfetalfetalliverwasabout5xl08;thepurifiedDNAwasaboutlg/L;andthebui11infragmentsweredifferentin

5、sizeafterdigestedwithEcoRIandXhoI.ConclusionThebaitvectorHCVcoreinyeasttwohybridsystem3isconstructedsuccessfully.ThediversityofcDNAofhumanfetalliverafteramplifiedandpurifiedissuitableforscreening.TheselayarigidbasisforfurtherstudyoftheHCVcoreproteinandmayhelpusinu

6、nderstandinghowHCVworks・KEYWORDS:HCVcoreprotein;yeasttwohybridsystem;cDNAgenebank内型肝炎病毒(HCV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因，全球超过1・7亿人口血清HCV抗体阳性。目前对于HCV感染尙无有效的预防疫苗,病毒蛋白对HCV感染细胞的功能影响还很不明确，利巴韦林和干扰索联合治疗仅对部分病例有效。这就迫切要求我们进一步了解病毒与细胞间的相互作用及免疫逃避机制。缺乏HCV感染和复制的组织培养系统、缺乏合适的HCV感染动物模型是

7、我们进行HCV发病机制硏究所面临的主要障碍［1］。分子生物学技术的发展为我们的硏究提供了新的思路。蛋白质勻蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础［2］。酵母双杂交系统是近年來新发展起来的一种分析真核细胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的一种有效的基因分析方法。酵母双杂交Gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转化效率高，假阳性率低等优点，我们利用它来克隆与HCV核心（core）蛋白相互作用蛋白的基因，以期为HCVcow蛋白功能的硏究提供新依据。1材料与方法1.1材料含HCV全长cDNA质粒PCDNA3.0

8、HCV由第四军医大学微生物教硏室尹文博士恵赠；表迖载休pGBKT7酵母菌种（美国Ciontech公司）；质粒pUC19菌种（本硏究室保存）；PCR试剂盒、DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（Gibco公司）；人肝酵母双杂交cDNA文库购自Clontcch公司。1.2方法1.2.1PCR扩