反义抑制miR-202引起斑马鱼早期胚胎发育异常研究.pdf

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1、文章编号:1674-5566(2017)01-0001-07DOI:10．12024/jsou．20160301705反义抑制miＲ-202引起斑马鱼早期胚胎发育异常研究11，2331，2许彦娜，韩兵社，郑英慧，戴中华，陈良标(1．上海海洋大学水产与生命学院，上海201306;2．上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306;3．中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京100101)摘要:为了探讨miＲ-202在鱼类胚胎发育中的功能，采用实时定量反转录PCＲ技术和整体原位杂交技术检测了miＲ-202在斑马鱼胚

2、胎发育阶段的表达。结果发现miＲ-202是母源性分子并在斑马鱼胚胎发育过程中持续表达，尤其在早期胚胎发育阶段表达水平较高。在此基础上，采用基因沉默技术在斑马鱼受精卵中显微注射miＲ-202的反义锁核苷酸，实时荧光定量反转录PCＲ技术和整体原位杂交技术结果显示miＲ-202反义锁核苷酸可以显著下调斑马鱼胚胎中miＲ-202表达水平，同时发现反义抑制miＲ-202后胚胎发育停滞在4hpf时左右。共同注射miＲ-202前体可以部分挽救反义抑制miＲ-202后导致的胚胎发育停滞。本研究证明miＲ-202在斑马鱼胚胎发育过程中起着重要的调控

3、作用，其功能是斑马鱼胚胎早期发育所必需的。为进一步探索miＲ-202在鱼类胚胎发育过程的功能奠定了基础。关键词:斑马鱼;胚胎发育;miＲ-202;基因沉默技术中图分类号:S917文献标志码:A［15］MicroＲNA(miＲNA)是一类长约22个核苷酸可以抑制神经母细胞瘤细胞增殖。miＲ-202的非编码ＲNA分子，通过与靶mＲNA的3'端非在小鼠、非洲爪蟾、大西洋圣日比目鱼成熟精巢［16-19］翻译区(3'UTＲ)碱基配对进行基因转录后调和鸡幼崽的精巢中特异性表达，在胚胎小鼠控［1-2］。2000年ＲEINHAＲT等［3］在线虫中

4、发现［16］性腺发育与分化和功能行使上起重要作用。调控时序性发育的基因let-7，随后逐渐在人类、有报道miＲ-202在鼠性腺中特异性表达，其表达［20］果蝇、小鼠等多种生物中鉴定出更多的miＲNAs，受到上游性别决定因子sox9的调控。而斑马已经发现miＲNA在细胞增殖、代谢、凋亡、肿瘤形鱼作为研究发育生物学的理想脊椎动物模型，却成以及免疫等众多不同的生物过程中起着重要没有miＲ-202在斑马鱼早期胚胎发育中的表达量［4-7］作用。目前，miＲNAs作为动物发育过程中的和调控作用的相关报道。一类重要调控因子而被广泛关注，它们在斑

5、马鱼在本研究中，我们首先利用实时定量反转录发育及正常生理过程中的调控功能也逐渐被揭PCＲ技术和整体原位杂交技术(Wholemountin［8］示。situhybridizationWISH)检测了miＲ-202在斑马鱼miＲ-202是与细胞分化相关的let-7家族成胚胎发育过程中的表达，随后采用锁核酸(locked员，其序列和功能在脊椎动物物种间具有高度保nucleicacid，LNA)修饰的miＲ-202反义核酸显微［9］守性。已有研究表明，miＲ-202在胃癌、乳腺注射斑马鱼第一细胞期胚胎，发现阻断miＲ-202癌、宫颈鳞状上

6、皮细胞癌、大肠癌、滤泡性淋巴瘤功能导致斑马鱼胚胎发育停滞在受精后4hpf左［10-14］等人类癌病中具有抑癌作用。另一项研究右，证明miＲ-202是斑马鱼胚胎发育所必需的，本表明原癌基因MYCN是miＲ-202的直接靶位点，研究为miＲ-202在斑马鱼早期胚胎发育中的功能收稿日期:2016-02-17修回日期:2016-05-11基金项目:国家自然科学基金(31130049);上海市自然科学基金(13ZＲ1419500);上海市教委水产学一流学科项目(沪教科2012-62)作者简介:许彦娜(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为

7、遗传与发育生物学。E-mail:catalya_xu@126．com通信作者:陈良标，E-mail:lbchen@shou．edu．cn2上海海洋大学学报26卷研究提供了重要基础。10μmol/L，注射体积为1nL/胚胎，注射部位为动物极。所有显微注射用的胚胎均为1细胞受1材料与方法精卵阶段，注射后的胚胎在28．5℃的培养箱中1．1材料培养观察，死亡的胚胎及时清除以排除对正常发实验用斑马鱼均为野生型AB品系，购自北育胚胎的影响。观察时间点为1、2、4、6、8、24京中国科学院遗传与发育生物学研究所，繁殖饲hpf，用显微镜观察并拍照

8、。养与交配取卵参照斑马鱼手册中的方法进行。1．3．2整体原位杂交水温为28．5℃，明暗光照周期分别为14h、10h。由Exqion公司合成3'地高辛标记的miＲ-2021．2仪器与试剂探针(表1)。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎，实验仪器包括冷冻离心