生物技术制药第八章 利用现代生物技术改造传统制药工业.ppt

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1、第八章利用现代生物技术改造传统制药工业现代生物技术不仅直接提供IFN、IL、EPO、CSF等基因工程药物，也广泛用于改造抗生素和生物制品等传统医药工业。主要体现在以下几个方面①抗生素：可从产生菌中分离出生物合成酶基因，进行克隆，提高生产菌的生物量，或得到新的杂合抗生素②氨基酸：利用生物技术得到基因克隆的生产菌，或采用融合技术提高氨基酸产量③维生素：构建基因工程菌，简化维生素的生产工艺（如VitC）④疫苗：利用基因工程技术将抗原克隆到E.coli或酵母中，用工程菌生产疫苗，产量高、工艺简单、操作安全概述第一节基因工程在抗生素生产中的应用抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，而是由初级代谢产物经

2、过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成过程是一个复杂的、多因素调节的过程传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱变剂（如紫外线、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产能力较高的突变株。80年代，人们开始将DNA重组技术应用于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法1.抗生素（链霉素）生物合成基因的结构特点①链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是G-C碱基组成，（G+C）%高达70%以上；且三联体密码子中第3个碱基G、C比例极高②抗生素生物合成基因大多处于一个基因族中③抗生素生物合成基因除定位在

3、染色体上外，有的定位于质粒上2.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物②阻断变株法③突变克隆法④直接克隆法⑤克隆抗生素抗性基因法⑥寡核苷酸探针法⑦同源基因杂交法①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物鸟枪克隆法：这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因

4、工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌DNA克隆到最常用的宿主——变青链霉菌中，通过检测宿主菌中个别基因产物，筛选克隆，从而分离到相应的基因②阻断变株法通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆DNA片段的性质。即首先经诱变获得一系列生物合成阻断变株（不能合成抗生素），用互补共合成法来确定这些变株在生物合成途径中的相互位置。从野生型菌株中分离DNA，

5、与载体连接后转入阻断变株，以抗生素表型的恢复作指标，克隆生物合成不同阶段的酶基因③突变克隆法利用整合质粒或噬菌体，将原株DNA转入到抗生素产生菌中。由于基因有同源性，有可能发生基因重组，一旦某DNA片段的插入干扰了原株某个生物合成基因的转录，即得到这个生物合成基因的阻断变株，其相应的DNA片段就是这个阶段的生物合成基因此法由于要利用噬菌体，因而有一定局限性④直接克隆法将抗生素产生菌的ＤＮＡ部分酶切的２０～４０bp的片段连接到质粒的表达位点上，转化变青链霉菌，培养，筛选具有抗菌活性转化子由于抗生素生物合成基因往往成族存在，使得有时可能需要克隆整套生物合成基因。故此法主要用于基因族相对较小（≤3

6、0kb）的抗生素生物合成基因⑤克隆抗生素抗性基因法抗生素生物合成基因和抗性基因往往是连锁的，表达也是协同的（否则菌体本身没有抗性，容易被自身所产生的抗生素杀灭），且抗性基因一般只有１～２kb，容易检测于克隆先将抗性基因克隆到标准宿主或产生菌的敏感突变株中，再分析与之紧密连锁的ＤＮＡ，就可能找到生物合成基因；也可利用已经克隆的抗性基因作为探针，从产生菌基因文库中分离与之同源的并带有生物合成基因的ＤＮＡ片段⑥寡核苷酸探针法根据抗生素生物合成酶基因的氨基酸序列，推导出其基因序列，然后人工合成寡核苷酸，并以此寡核苷酸作为探针，从基因文库中克隆出相应的生物合成基因⑦同源基因杂交法利用一种已经克隆的抗生

7、素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因二、提高抗生素产量在抗生素生产过程中，获得高产菌株的传统方法是通过诱变育种得到的；而利用基因工程技术提高抗生素产量应从以下方面着手1.将抗生素产生菌基因随机克隆到原株直接筛选高产菌株原理：在克隆菌中，增加某一与产量有关的基因（限速阶段的正性调节基因）的剂量，使产量提高2.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数抗生素生物合成途径中的