【精品】醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究.doc

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1、第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属抄，乂名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6〜0.8x1.0〜3.0pm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表而屮都有生长⑶］。醋酸菌是酿醋过程屮不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且

2、还有醇类他。本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋酷。试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.ao表2.2.1.a主要仪器设备Tab2.2」.aMaininstrumentequipment主要仪器型号厂家生化培养箱PYX-250S-A长沙科技双Fl生物显微镜BME(BA/E3)科力仪器分析天平BS224S徳国莱卡手提式不锈钢蒸汽灭菌锅DSX-280B北京化丰超净工作台SW-CJ-1FD上海

3、南鹏精密数字式酸度计pHS-3C上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、廿油、无水乙醇(95%)、CaC6、(NH4)2SO4>K2HPO4、KH2PO4、MgSO4-7H2O>FeCl3>乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯;琼脂食用级。2.2.2培养基［回表2.2.1.b培养基成分表Tab2.2.1.bMediumcomposition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注(1)基础发酵培养基1%1%3%pH4.5(2)分离培养1%1%3%2%2%pH白然(3)斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然(5)

4、改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然(6)发酵培养基1%1%7%pH4.5(7)Horyer-Frateur培养基3%pH白然(8)GYC培养基10%5%2%2.5%pH自然(9)高糖培养基30%1%2%2%pH自然(10)生酮培养基3%2%甘油3%(11)产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然(12)氧化乙酸培养基1%1%2%乙酸钙l%pH7.2(13)氧化乳酸培养基1%1%2%乳酸钙2%pH7.0-7.2(14)乙醇培养基1%3%2%pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30°C培养24h,加入无菌碳酸钙，灌入并液

5、体培养基到斜面上,至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%,K2HPO4O.I%,KH2PO4O.01%,0.025%,FeCl30.0005%；以上培养基均以121°C灭菌20min。223醋酸菌的分离纯化2.2.3.1分离纯化实验称取醋酷样品5g,液态增殖培养48h后，按照浓度梯度lOUIO"和10巴涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈乂大乂清晰的单菌落，转接并保藏于4°C的冰箱。2.23.2革兰氏染色实验将上述活化后的菌株，接种于新鲜

6、的培养基培养24h,制作水品镜片进行革兰氏染色。2.23.3产醋酸定性实验的取活化好的斜而菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3%(v/v)的无水乙醇，32°C震荡培养60h,取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液(2.5mol/L)调节pH至7.0,加入5〜6滴5%FeCl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌⑴］为醋酸菌。2.23.4醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32°C、140r/min恒温震荡培养60h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。

7、醋酸定量测定［①：精确吸取发酵液2mL至250mL三角瓶中，并加入蒸馆水50mL,滴加1〜2滴0.5%的酒精酚瞅溶液，用已标定过的()」mol/LNaOH溶液滴定至微粉色。产酸i(g/L)=(V-V0)xCNaOHx60/样品毫升数;式中：V二发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V()=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；CNaOH=NaOH溶液的浓度(mol/L)；60为醋酸分子量。2.23.5耐酒精能力实验初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%,每个梯度相差1%,32°C恒温培养3d,观察其

8、是否生长,筛选出耐酒精性能好的菌株。2.23.6传代稳定性实验⑷】将上述所筛选出的菌株，每隔一