醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究

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1、第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0μm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，

2、会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。2.2实验材料与方法2.2.1　材料与仪器　分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。表2.2.1.a主要仪器设备Tab2.2.1.aMaininstrumentequipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-

3、CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。2.2.2　培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab2.2.1.ｂMediumcomposition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH4.5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%

4、2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH4.5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2%2.5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1%1%2%乙酸钙1%pH7.2⒀氧化乳酸培养基1%1%2%乳酸钙2%pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1%3%2%pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养

5、基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40.01%，0.025%，FeCl30.0005%；以上培养基均以121℃灭菌20min。第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.2.3　醋酸菌的分离纯化2.2.3.1分离纯化实验称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4℃的冰箱。2.2.3.2革兰氏染色实

6、验将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24h，制作水晶镜片进行革兰氏染色。2.2.3.3产醋酸定性实验[38]取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3%(v/v)的无水乙醇，32℃震荡培养60h，取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液（2.5mol/L）调节pH至7.0，加入5~6滴5%FeCl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39]为醋酸菌。2.2.3.4醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32℃、140r/min恒温震荡培养60h后，检测

7、其发酵液中总酸，每株平行3组。醋酸定量测定[40]：精确吸取发酵液2mL至250mL三角瓶中，并加入蒸馏水50mL，滴加1~2滴0.5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1mol/LNaOH溶液滴定至微粉色。产酸量(g/L)=(V-V0)×CNaOH×60/样品毫升数；式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；CNaOH=NaOH溶液的浓度(mol/L)；60为醋酸分子量。第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.2.3.5　耐酒精能力实验初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从

8、5%到14