番外编：いろいろな电気泳动.ppt

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1、二次元電気泳動の基本補足：分子量の求め方SDS－PAGEの泳動像から分子量を推定するには？タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質のものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる同じゲルの中で既知のタンパク質（分子量マーカー）を泳動する分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する移動距離を片対グラフにプロットするこれを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求めるSDS-PAGEの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質分子量算出の手順～バンドが

2、綺麗に揃ったゲルの場合～１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの移動距離を正確にはかる分子量マーカーサンプル44.6mm33.523.612.76.73.6２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする３）移動度－分子量標準曲線を求める４）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる５）その数値を３）で求めた標準曲線の式（y＝267249ｘ－0.7341）に代入し分子量を算出する分子量マーカ

3、ーサンプル28.5mm267249×28.5－0.7341＝22851.49求めるタンパクの分子量分子量算出の手順～スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合～１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの移動距離を正確にはかる２）レーンの同じ場所で泳動のフロントラインの移動距離を正確にはかる分子量マーカーサンプルBPB分子量マーカーサンプル３）フロントラインの移動距離を１として、それぞれの分子量マーカーのバン　　ドの移動距離の相対値（＝相対移動度：Rf値）を計算する0.2

4、50.671.0４）片対グラフの横軸（普通目盛）にＲｆ値、縦軸（対数目盛）に分子量をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする５）Rf値－分子量標準曲線を求める７）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる８）そのサンプルが流れているレーンの同じ場所で、泳動のフロントライン　　の移動距離をはかる９）フロントラインの移動距離を１として、目的のタンパク質のＲｆ値を計算し５）で求めた標準曲線の式（y=15154x－0.7425）に代入すると、分子量が算出できる分子量マーカーサンプル0.

5、571.015154×0.57－0.7425＝22771.73求めるタンパクの分子量二次元電気泳動での分子量マーカーの使い方分子量マーカーのバンドSDS-PAGEで分子量を測定する上での注意点・塩基性に富んだタンパク質はSDSの結合量が少なくなるため、移動度が小さくなる＝見かけの分子量が大きくなる・タンパク分子内に疎水性に富んだ部分が多い場合は、SDSの結合量も多くなり、移動度が大きくなる＝見かけの分子量が小さくなる・糖タンパク質や酸性タンパク質はSDSの結合量が少なく、移動度も小さい＝見かけの

6、分子量が大きくなる・多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子では、SDS-PAGEでわかるのはその単一ポリペプチドの分子量だけで、その分子が生体内で機能している状態の分子量はわからない例）　　免疫グロブリン＝重鎖2本と軽鎖2本がS-S結合した構造をもつS-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れる免疫グロブリンの構造黄色い部分＝Lightchain（L鎖）緑色の部分＝Heavychain（H鎖）2本のL鎖と2本のH鎖で構成されているL鎖とH鎖、H鎖とH

7、鎖同士はS-S結合で結ばれている