合肥地区鸡源大肠杆菌耐药性检测及相关耐药基因研究.pdf

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1、摘要现代畜禽养殖业日趋规模化和集约化，大肠杆菌病成为危害畜禽养殖业的主要传染病之一，给其造成了严重的经济损失。因此，临床上的各种抗菌药物被用来防控大肠杆菌病，由于不合理地使用甚至滥用，大肠杆菌耐药性日趋严重，多重耐药菌株不断增加，对养殖业的发展和人类的健康造成了严重威胁。本研究是为了解安徽省合肥地区鸡源大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）的耐药性现状以及整合子基因盒（integronsandgenecassettes）、超广谱β-内酰胺酶基因（ESBL,extended-spectrumβ-lactamasegenes）、质粒介导喹诺酮耐药基因（PMQR

2、,plasmid-mediatedfluoroquinoloneresistance）、四环素类耐药基因、酰胺醇类耐药基因和16SrRNA甲基化酶基因的流行状况、连锁情况及其传播特点。本研究从安徽省合肥地区四个养鸡场采集、分离菌株，经大肠杆菌鉴别培养基培养、微量生化试验管鉴定及PCR（polymerasechainreaction）检测，共鉴定出184株鸡源大肠杆菌。参考美国临床和实验室标准协会（CLSI,2010）推荐的微量肉汤稀释法对184株大肠杆菌进行药敏实验，结果显示，184株大肠杆菌对临床上14种抗菌药物的耐药性有较大差异，对土霉素（97.8%）、磺胺六甲氧嘧啶（

3、97.3%）、强力霉素（90.2%）、阿莫西林（82.6%）、洛美沙星（77.7%）、氧氟沙星（67.4%）、恩诺沙星（55.9%）和氟苯尼考（52.7%）的耐药率较高；对阿米卡星和沙拉沙星的耐药率较低，分别是7.6%和2.2%。多重耐药现象明显，72.3%的菌株为6耐以上，13.6%的菌株耐10种以上抗菌药物。在获得分离菌株药物敏感性实验结果的基础上，针对I、II型整合子的整合酶基因序列设计引物，用PCR方法检测分离菌株中流行的整合子类型，然后设计可变区通用引物，扩增整合子携带的基因盒插入区，测序分析其携带的基因盒种类。结果发现，184株鸡源大肠杆菌中91株检出I型整合子

4、，检出率为49.5%，未检出II型整合子。I型整合子阳性菌株中70株扩增出3种大小不同的基因盒插入区片段，主要是二氢叶酸还原酶基因（dfr）和氨基糖苷类抗生素耐药基因（aadA），21株未扩增出基因盒插入区片段；最普遍的基因盒列阵为dfrA1-tnpAIS26-aadA1。统计学分析表明，整合子阳性菌株的多重耐药率显著高于整合子阴性菌株（p<0.05），说明大肠杆菌的多重耐药性与整合子阳性检出率显著相关。本研究采用PCR方法检测184株大肠杆菌中ESBL、PMQR、四环素类耐药基因、酰胺醇类耐药基因和16SrRNA甲基化酶基因的流行状况，结果显示，57.6%（106/184

5、）的大肠杆菌检测出了ESBL基因，46.2%（85/184）的大肠杆菌检测出了PMQR基因，四环素耐药基因和酰胺醇类耐药基因的检出率分别为17.4%（32/184），15.8%I（29/184），只有一株大肠杆菌携带16SrRNA甲基化酶基因。各种耐药基因在82株大肠杆菌中存在连锁流行的情况，其中，26株大肠杆菌携带3种耐药基因，5株携带4种耐药基因，携带5种耐药基因的有3株，只有一株同时携带6种耐药基因。采用脉冲场凝胶电泳（pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE）技术对91株I型整合子阳性菌株进行分型，共分为63种亚型，谱型比较分散，未发现绝

6、对优势谱型。综上所述，本研究认为安徽省合肥地区鸡源大肠杆菌的耐药情况较为严峻，ESBL（57.6%）、PMQR（46.2%）和I型整合子（49.5%）的检出率均较高。PFGE谱型比较分散，未发现绝对优势谱型，说明菌株在基因水平上具有多态性。本研究通过调查合肥地区鸡源大肠杆菌的耐药性、耐药基因流行情况以及分子分型，初步揭示了耐药基因在菌株耐药性尤其是多重耐药性产生的过程中发挥了重要作用，为指导兽医临床合理用药，防治疾病以及预防和控制耐药性、耐药基因的传播提供了理论依据。关键词：鸡，大肠杆菌，整合子-基因盒，耐药基因，脉冲场凝胶电泳IIAbstractModernpoultry

7、industryincreasinglybecomelarge-scaleandintensive,whichcausedcolibacillosishasbecomeoneofthemajorinfectiousdiseasesandhasbroughtgreateconomiclosstopoultryindustry.Tocontrolandtreatcolibacillosis,abuseandoveruseofantibioticshasbroughtsevereresistance,multi-drug