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1、ICSDB52省地方标准DB52/TXXXX—2014贵州辣椒品种SSR标记鉴定技术规程（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。2014-XX-XX实施2014-XX-XX发布贵州省质量技术监督局木标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则笫1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。木标准由贵州省农业委员会提出并归M。本标准由贵州省质量技术监督局批准。木标准起草单位：贵州省辣椒研究所、贵州省旱粮研究所。本标准主要起草人：何建文、杨文鹏。贵州辣椒品种SSR标记鉴定技术规程1范围木规稈规定了辣椒品种SSR标记鉴定方法。木标准范围适用于贵
2、州辣椒品种及种质资源鉴定。2规范性引用文件下列文件对于木文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅所注口期的版木适用于本文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版木(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于木标准。3.1SSR(简单重复序列)(SimpleSequenceRepeat,SSR)也称微卫星DNA,其串联重复的核心序列为1bp〜6bp,其屮最常见是双核廿酸重复，即(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10个-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。4试剂4
3、.1总则以下所用试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂，水符合国家GB/T6682屮规定的一级水标准。4.21M三轻甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCI称量121.IgTris置于IL烧杯屮，加入约SOOmL的去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调pH值至8.0,加ddH2O定容至1L。4.20.5M乙二胺四乙酸二钠EDTA称取186.IgEDTA置于1L烧杯屮，加入约800汕的去离了水，充分搅拌。用NaOII调节pll值至8.0,加dcBO定容至1L。4.35XTBE缓冲液称取54gTris-base、27.5g硼酸(H3BO3)、3.72gEDTA(乙二胺四乙酸二钠)加ddlbO
4、定容至1L。4.4CTAB提取液分别量取10mllmol/LTris-HCL、30ml0.5mol/LEDTA、42ml5mol/LNaCKPVP2g、CTAB2g,加水溶解后定容至100ml,使用前加入lml毓基乙醇。4.56%变性测序胶称取460g尿素，57g丙烯酰胺，3g甲叉双丙烯酰胺，200ml5XTBE溶液，再加少量ddH2O,短暂加热（才37C）,搅溶溶解，滤纸过滤，加水定容至1000mlo4.7固定液量取无水乙醇75ml,冰醋酸3.5ml,加ddlbO定容至1L。4.8染色液称量2g硝酸银溶于II,cldH,0o4.9显影液称量15gNaOH,4ml甲醛混合均
5、匀，加ddlW至1L。3.10终止液称量7.5gffeg溶于ILddH2O屮。5仪器设备分析天平、纯水仪、制冰机、台式低温冷冻离心机、移液器、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、核酸蛋片分析仪、垂直电泳槽、水平电泳槽、超低温冰箱、冰箱、液氮鑼、数码相机、电脑。6辣椒品种鉴定的SSR标记Hpmsl〜139、CA514621、CA515055、BM59622、BM61910.CP1006KAF208&34、hpmsl〜274、CM10、Ilpmsl〜143、CA52621KCA847460、Hpmsl〜281、IIpms2〜13、Ilpmsl〜3、IIpms2〜41、CA51427
6、2、GP1078、GP20036、hpmsl〜214、CA515649、CA517699、CAN130829.Hpmsl〜69、BM6146KCB164897、Hpms2〜45、CA523558.CA525390、Hpms2〜281。7分析步骤7.1样品采集采集辣椒植株顶部幼嫩叶片lg〜2g,叶片样品用牛皮纸包装，冰盒携带，4°C保存。7.2辣椒基因组DNA提取7.2.1用1.5ml离心管盖取幼苗叶片（约1加g〜15mg）,置于冰上。7.2.2加抽提液lOOgL,研磨成浆。7.2.365°C水浴20min〜40min,其间颠倒离心管两次。7.2.4取出微离心管，放置5【ni
7、n〜10min,冷至室温。7.2.5加入IOOjiL的苯酚：氯仿：异戊醉（25：24：1）,上下颠倒混合5min,3200rpm〜12000rpm离心lOmirio7.2.6转移上清至另一支1.5ml离心管，加入7.5
8、iL5mol/LNaCl,用100u1无水乙醇（冰冻或室温）沉淀DNAo7.2.7短暂离心，除去乙醇，用75%乙醇洗涤，12000rpm离心5min,弃乙醇，自然干燥至没有乙醇气味。7.2.8加入200口灭菌ddH20或TE（pH二8.0）,4°C溶解DNA。7.2.94°C或-20°C储存。7.3
