DB43T 987-2015 辣椒品种纯度鉴定SSR分子标记法

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1、ICS65.020.20B05DB43湖南省地方标准DB43/T987—2015辣椒品种纯度鉴定SSR分子标记法ProtocolforpurityidentificationofpeppervarietybySSRmolecularmarkers2015-01-23发布2015-03-23实施湖南省质量技术监督局发布DB43/T987—2015目次前言……………………………………………………………………………………………………Ⅱ1范围……………………………………………………………………………………………………12原理……

2、…………………………………………………………………………………………13仪器设备、试剂和耗材…………………………………………………………………………………13.1主要仪器设备…………………………………………………………………………………13.2主要试剂………………………………………………………………………………………13.3主要耗材…………………………………………………………………………………………14试剂配制…………………………………………………………………………………………14.1DNA提取试剂……………………………

3、…………………………………………………………14.2PCR扩增试剂……………………………………………………………………………………24.3变性聚丙烯凝胶电泳试剂………………………………………………………………………24.4银染、显影试剂…………………………………………………………………………………24.5显影液……………………………………………………………………………………………35引物…………………………………………………………………………………………………36操作步骤…………………………………………………………………

4、…………………………36.1供试品种样品制备……………………………………………………………………………36.2DNA提取…………………………………………………………………………………36.3PCR反应体系和程序………………………………………………………………………36.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………………………………………………………36.5染色和显色………………………………………………………………………………………47统计与计算…………………………………………………………………………………………4附录A（资

5、料性附录）部分SSR引物信息……………………………………………………………6IDB43/T987—2015前言本标准按照GB/G1.1—2009给出的规则起草。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省农业标准化技术委员会提出并归口。本标准主要起草单位：湖南省蔬菜研究所。本标准主要起草人：郑井元、刘峰、邹学校、张竹青、马艳青、戴雄泽、李雪峰。IIDB43/T987—2015辣椒品种纯度鉴定SSR分子标记法1范围本标准规定了辣椒品种纯度SSR分子标记鉴定技术。本标准适用于采用S

6、SR分子标记法进行辣椒品种纯度鉴定。2原理简单重复序列（Simplesequencerepeats:SSR）随机分布于辣椒全基因组的不同位置上，不同品种或品系每个位点上重复单位的数量和序列可能不同，从而形成片段长度多态性。根据基因组中每个简单重复序列两侧序列的保守性，设计一对特异引物，利用PCR(PolymeraseChainRaction)技术进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，经硝酸银染色，从而判别PCR产物的电泳谱带，通过选用供试品种间具有广泛多态性的SSR引物，依据PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中的

7、电泳谱带差异，鉴定辣椒品种纯度。3仪器设备、试剂和耗材3.1主要仪器设备研钵、液氮罐、电子天平、恒温水浴锅、高速台式离心机（14000r/min）、紫外分光光度计、高压灭菌锅、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、通风柜、数码相机、胶片观察灯、冰箱（4℃和-20℃）。3.2主要试剂乙二胺四乙酸二钠、盐酸、氢氧化钠、液氮、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸钠、三氯甲烷、乙醇、异丙醇、异戊醇、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)引物、TaqDNA聚合酶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、

8、硼酸、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、醋酸钠，所以试剂符合分析纯以上标准。3.3主要耗材离心管、移液枪枪头、96孔PCR扩增板、玻璃板、一次性手套、一次性口罩。4试剂配制4.1DNA提取试剂4.1.10.5mol/LEDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）（pH8.0）溶液称EDTA186.1g，加入已有800m