尼氏染色-全面.ppt

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1、用尼氏染色法观察小鼠海马及皮层中神经元的分布情况神经生物学实验室一、实验原理尼氏染色法（Nisslstaining）是德国病理学家F.Nissl（1860-1919）于1892年创立的，碱性染料染色后发现了神经元胞体中的尼氏体。神经元是神经系统的结构和功能单位,尼氏体是神经元的特征性结构之一,尼氏体（Nisslbody）又称虎斑,广泛存在于神经元胞体和树突内,具有嗜碱性的特点。以往显示神经元中尼氏体多采用苏木精-伊红染色方法,此法虽然也能观察到胞质中嗜碱性颗粒,但结构不甚清晰,胞核、核仁、尼氏体颗粒模糊,分界不清,轴突、树突难以辨认。在尼氏染色中尼氏体清晰可辨,核、核仁

2、也非常清晰,而且很容易区分轴突和树突,收到了既可辨认器官又可同时观察细胞质特殊结构的效果。尼氏染色法的优势何在？尼氏染色中尼氏体受染后呈块状(形如虎斑)或颗粒状,核周围尼氏体颗粒较大,近边缘处较小而细长。在电镜下观察，尼氏体主要由平行排列的粗面内质网和核糖体组成。尼氏体的主要功能是合成蛋白质，作为神经活动时所需，如细胞中的某些成分的更新以及产生神经递质有关的蛋白质和酶类。轴突端的蛋白质大都来自胞体的尼氏体。神经元在兴奋传导过程中，不断消耗某些蛋白质物质，尼氏体可合成新的蛋白质以补充这种消耗。在生理情况下,Nissl小体大而数量多，说明神经细胞合成蛋白质的功能较强；相反在

3、神经细胞受到损伤时，Nissl小体的数量会减少甚至消失。尼氏体的功能是什么？用于尼氏染色的常用染料有：焦油紫（cresylviolet）、硫堇（thionine）和甲苯胺蓝(toluidineblue)。二、实验步骤1、昆明小鼠以0.48%的戊巴比妥钠0.02ml/g腹腔注射麻醉，待其麻醉后，迅速用手术剪刀及镊子剪开肚皮使其心脏暴露，将针头从右心房插入，并用动脉夹夹住，剪破静脉窦。2、灌流和固定：先用生理盐水灌注（约30min），待小鼠肝脏变白后，再换成4%多聚甲醛灌流，直到小鼠肝脏变硬，尾巴僵硬为止（约2h）。3、待充分固定后，剪下小鼠头部并开颅取脑，再浸入4%多聚甲

4、醛1d。4、将脑组织用502胶水固定，在振荡切片机上切片，厚度为25μm。5、将切好的脑片浸于0.5%的明胶中，用毛刷将脑片贴到预先用明胶处理的载玻片上，然后自然风干。6、切片染色：将脑片置于0.5%甲苯胺蓝（母液：甲苯胺蓝1g，无水乙醇100ml。使用时按1:1比例与新鲜的0.1%NaCl溶液混合成工作液）或焦油紫（焦油紫0.1g；蒸馏水99ml；1%冰醋酸1ml）中室温下染色30min；7、切片用蒸馏水冲洗3次；8、切片依次浸入75%、80%、95%的酒精中，每次约1min；9、切片入特殊分色液中分色，约15s；10、切片浸入100%酒精I，II，各1min；11、

5、切片浸入二甲苯I，II中透明，各5min；12、中性树胶封片。13、显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进行计数。三、注意事项Nissl染色液的染色能力很强，并且染色后很难去除，请注意勿使染色液沾染皮肤和衣物等。四、思考题除了尼氏染色法以外，你知道还有哪些方法可以对神经元进行特殊的染色，并详述其原理和步骤。