课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptx

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1、聚合酶链式反应PCR:PolymeraseChainReaction浠水一中陈旭学习目标生命观念科学思维通过比较细胞内DNA复制和体外复制的相同点和不同点，能够运用结构与功能观、物质与能量观，阐明PCR的反应条件、基本原理和反应过程科学思维科学探究通过学习PCR技术的产生和发展历史，能够体会演绎推理和创造性思维在科学研究发现中的重要作用重点：PCR的原理和条件一难点：PCR的原理和条件二重难点PCR技术多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的

2、技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。内容条件细胞内的DNA复制需要哪些条件？解旋酶、DNA聚合酶等DNA的两条链4种脱氧核苷酸？酶（催化解旋、聚合等）模板原料能量DNA复制作用细胞内的DNA复制需要哪些条件？解旋酶+能量DNA母链DNA聚合酶4种脱氧核苷酸(dNTP)dNTP引物打开DNA双链做为模板催化合成D

3、NA子链合成子链的原料提供聚合反应所需的能量使DNA聚合酶能够从引物的3’末端开始连接脱氧核苷酸？？作为体外模拟DNA复制的PCR技术，是如何模拟的呢？DNA复制解旋酶+能量DNA母链DNA聚合酶4种脱氧核苷酸(dNTP)小段RNA，由引物酶合成PCR加热（90～95℃）DNA母链耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）4种脱氧核苷酸(dNTP)小段DNA，一般由化学法人工合成作用打开DNA双链做为模板催化合成DNA子链作为原料及供能作为引物????PCR是对DNA复制的体外模拟1971年，Khorana提出：

4、经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，所以，Khorana的设想被人们遗忘了。但这个设想被Sanger等用于DNA测序，并获得了1980年诺贝尔化学奖。PCR技术发展简史1983年，在Cetus公司工作的穆利斯（Mullis）突然萌发了一个想法：如果用两条引物同时扩增模板DNA的两条链，那么一生二、二生四、四变无穷……这就是聚合酶链式反应。PCR技术发展简史95℃变性50-65℃退火XX℃延伸95℃（变性）55℃（复性/

5、退火）37℃(延伸)加入大肠杆菌DNA聚合酶PCR循环这是个劳动密集型的工作，不仅繁琐，而且昂贵使PCR真正广泛应用的，是耐高温的DNA聚合酶的使用我国台湾的科学家钱嘉韵第一个报道分离出了耐高温DNA聚合酶1973年，钱嘉韵在美国辛辛那提大学生物系时，首次从美国黄石公园热泉里的嗜热菌Taq菌中分离了耐高温的TaqDNA聚合酶，并于1976年发表这一成果。TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020热泉的高温条件淘汰了绝大

6、多数微生物，而使耐热的Taq菌脱颖而出。高温条件选择了Taq菌，Taq菌选择了耐热的Taq酶。问题：为什么能够很快从热泉中的Taq菌里发现耐热的DNA聚合酶呢？为什么大肠杆菌里没有耐热的DNA聚合酶？95℃（变性）55℃（复性/退火）72℃(延伸)TaqDNA聚合酶PCR循环1986年春，Mullis首次提出耐高温酶的使用；同年6月，Cetus公司首度将Taq酶应用于PCR，大获成功1988年，第一台PCR仪（即热循环仪）问世1993年穆利斯PCR获得诺贝尔化学奖PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72

7、˚C退火55˚C25～35轮预变性95˚C5minDNA复制解旋酶+能量DNA母链DNA聚合酶4种脱氧核苷酸(dNTP)小段RNA，由引物酶合成PCR加热（90～95℃）DNA母链耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）4种脱氧核苷酸(dNTP)小段DNA，一般由化学法人工合成作用打开DNA双链做为模板催化合成DNA子链作为原料及供能作为引物??PCR是对DNA复制的体外模拟PCR反应演示PCR知识总结PCR六要素：模板引物dNTP耐热DNA聚合酶（Taq酶）缓冲液（含Mg2+）热循环装置（PCR仪）PCR知识

8、总结PCR的实质体外模拟的DNA复制PCR的产物两条引物之间的DNA片段PCR的过程预变性变性复性（退火）延伸当堂训练1、下列符合PCR反应条件的是（　　）①稳定的缓冲液环境　②DNA模板　③合成引物　④四种脱氧核苷酸　⑤DNA聚合酶　⑥DNA解旋酶　⑦限制性内切酶　⑧温控设备．A.①②③④⑤⑥B.①②③④⑤⑥⑦⑧C.③④⑤⑥⑦⑧D.①②③④⑤⑧√当堂训练2、PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（　　）①PCR过程