资源描述：
《蛋白相互作用.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、研究蛋白相互作用的方法：酵母双杂交酵母双杂交的缺点1)相互作用必须在酵母中进行,许多外源目标蛋白在酵母中表达天然活性已经发生变化;2)各种原因造成的假阳性,例如一些受试蛋白本身可能激活了报告基因的转录或在酵母双杂交系统中相互作用的蛋白在其天然环境中处于不同细胞器,并不发生相互作用;3)必须通过酵母细胞培养才能观察到结果,耗时较长.IdentifyingProtein-Protein Interactions:FRETIdentifyingProtein-Protein Interactions:FRET青色荧光蛋白（c
2、yanfluorescentprotein,CFP）、黄色荧光蛋白（yellowfluorescentprotein,YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器
3、所接收到的荧光就越少。FRET和BRET技术对仪器的要求高,需要复杂的数据分析.同时,这类方法检测的是供体和受体的荧光强度的变化.BimolecularFluorescence Complementation(BiFC)2000年,Ghosh等首次报道了1个借助反向平行的亮氨酸拉链介导的GFP重组实验.该实验选用了易被检测的GFP蛋白,将其从氨基酸Gln157-Lys158位切开,把1组反向平行的亮氨酸拉链分别连接到GFP的N端和C端.,将1个亮氨酸拉链(NZ)通过1个连接肽连接到GFP的N片段的第157个氨基酸上,另
4、1个亮氨酸拉链(CZ)连接到C端片段的第158位氨基酸.在体外和体内(大肠杆菌BL21中)分别证明了,只有借助亮氨酸拉链的相互作用,GFP的2个多肽片段才能够靠近,重新形成完整的GFP蛋白,并发射荧光.2003年,Hu和Kerppola[29]系统地研究了GFP及其3个不同颜色的突变体蓝色荧光蛋白(BFP),青色荧光蛋白(CFP)以及黄色荧光蛋白(YFP)的BiFC现象.他们把GFP,BFP,CFP,YFP从氨基酸155位和173位分别切开,把切开的N端片段用其颜色和位点命名,如NY155,NG173等BiFC技术正是
5、利用该荧光蛋白家族的这一特性，在环结构的特异位点将荧光蛋白切成N端片段和C端片段两部分后，再由一小段氨基酸序列(linker)分别与目标蛋白连接.重组好的基因构建入载体，共转染细胞.两段重组基因在细胞中融合表达，若目标蛋白间存在相互作用，通过linker牵引荧光蛋白的N端片段与C端片段就能够相互靠近，进而形成荧光蛋白生色团重新发出荧光.因此，在荧光显微镜下检测是否有互补荧光产生，就可以推断出两目标蛋白是否发生了相互作用。BimolecularFluorescence Complementation(BiFC)Bimol
6、ecularFluorescence Complementation(BiFC)优点：BiFC系统对仪器要求低、数据处理相对简单,由于只是检测荧光的有无,因而背景干净,检测更加灵敏.重建后的荧光蛋白结构较稳定,双分子荧光互补技术还可以用于研究蛋白质之间的弱相互作用或瞬间相互作用[BiFC技术的最大缺陷是多个BiFC系统对温度敏感.温度高时,片段间不易互补形成完整的荧光蛋白.一般在30℃以下形成互补效应好,温度越低,越有利于片段之间的互补,这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素.目前,只有基于venus、
7、citrine和cerulean的3个双分子荧光互补系统可以在生理温度条件下实现片段互补[30].此外,BiFC系统需要2个荧光蛋白片段互补,重新形成完整的活性蛋白以及发生荧光蛋白自体催化过程,不同的BiFC系统往往需要几分钟到几小时完成该过程,因此观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程,不能实时地观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程.
