蛋白质相互作用ppt课件.ppt

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1、蛋白质相互作用的研究方法DNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态蛋白质相互作用温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控人类蛋白质组相用有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用的。蛋白质－核酸间相互作用研究蛋白质－蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用的形式1、蛋白质亚基的聚合2、交叉聚合3、分子识别4、分子的自我装配5、多酶复合体蛋白质之间的相互作用力氢键范德华力疏水键离子键免疫共沉淀荧光共振转移技术噬菌体展

2、示技术酵母双杂交技术基因外抑制子合成致死筛选分子生物学方法亲和印迹Pulldown试验遗传学方法蛋白质相互作用研究方法生物物理学方法融合蛋白pull-down实验融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。洗脱（2）结合（3）检测（6）收集（5）洗脱（4）固定诱饵蛋白（1）为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯

3、化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。GSTPull-down方法此方法的基本原理是：利用重组技术将诱饵蛋白与GST（GlutathioneStransferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用实验方法：1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重

4、组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应4ºC2h3）离心弃上清4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，离心5）取上清进行SDS-PAGE电泳，6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行GST-PulldownAssayGSTpull-downassayGST-fusionproteinGSTalone免疫共

5、沉淀(co-IP)技术基于与蛋白质X与Y的生理性相互作用，如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，则蛋白质Y也可能沉淀下来。Y的这种免疫沉淀被称为免疫共沉淀(co-immunocipitation,Co-IP)，此法最常用于测定两种目标蛋白质在体内的结合。YABY裂解细胞免疫共沉淀蛋白质X免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白

6、质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。原理Co-IP工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYY收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4°c，最大转速离心30min后取上清；取少量裂解液以备westernblot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°c缓慢

7、摇晃孵育过夜；取10μlproteina琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；将预处理过的10μlproteina琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°c缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteina琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在4°c以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×sds上样缓冲液，沸水煮5分钟；sds-page,westernblotting或质谱仪分析。实验步骤利用western

8、blot确定捕获蛋白通过质谱确定捕获的蛋白实验注意事项（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（np40或tritonx-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2sds)，细胞裂解液中要加