制药092第二组.ppt

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1、西瓜细胞核雄性不育系雄花蕾的mRNA差异表达分析生物技术093第二小组摘要：为阐明西瓜G17AB系雄性不育发生的分子机制，采用mRNA差异显示技术，分析了不育株与可育株雄花蕾发育过程中基因表达的差异，经重复验证，获得了2个稳定表达的差异cDNA片段:C13F和G10S。经克隆测序和同源性分析，C13F片段与拟南芥β-葡萄糖苷酶酶蛋白的部分编码序列具有80％同源性；G10S片断与菜豆泛素mRNA的编码序列具有92%同源性。关键词：西瓜；细胞核雄性不育；mRNA差异显示前言植物花粉发育的分子生物学，已经成为植物分子生物学

2、研究中的热点领域。在花粉的发育过程中，涉及近万种特异基因的表达，但目前已鉴定的花粉发育特异基因不过几十种[1]。因此，研究花药、花粉在发育过程中基因表达的时空特异性，分离相关特异基因和特异启动子，对于认识植物花粉发育的分子机理具有重要意义。Liang等[2]在1992年首先建立的mRNA差异显示技术，为研究基因表达调控提供了一种简便有效的方法。这种方法克服了以往鉴别基因差异表达方法如减法杂交和差异杂交等存在的实验周期长、操作复杂、效率低、费用高等缺点，被各国学者广泛采用并不断改进，应用于与生物发育密切相关的许多领域。

3、1988年，夏锡桐等[3]在龙蜜100号西瓜自交后代中发现了雄性不育株并选育G17AB雄性不育两用系，此后有关西瓜雄性不育材料的发现及研究报道较多，主要集中在细胞形态、生理生化和分子标记等方面[4-6]，而有关不育和可育基因表达差异的研究罕见报道。西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系经过多代系内自交，不育株与可育株具有相同的遗传背景，两者仅雄花表现不同育性，是研究育性基因时空表达的理想材料。本实验室在对西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系的细胞形态、生理生化和分子标记研究的基础上，采用mRNA差异显示技术，对西瓜G17A

4、B细胞核雄性不育两用系的可育株与不育株雄花蕾发育过程中的基因表达差异进行研究，以期阐明西瓜细胞核雄性不育发生的分子机理。1.材料和方法1.1材料春季将西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系定植于日光温室内，雄花开放时鉴别可育株和不育株并挂牌编号，选取不育株和可育株各10株，摘取全部雄花蕾及开放当天的雄花后按不育和可育混合。采集的样品经液氮处理后立即置于-70℃冰箱中保存备用。1.2试剂TakaraRNAPCRKit（AMV）Ver2.1，DNaseⅠ，T4RNA连接酶，dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNA分子量Mark

5、er均购自Takara公司，其余试剂为国产分析纯。1.3引物表1、表2中的3条锚定引物和26条随机引物由上海博亚生物技术有限公司合成。1.4西瓜G17AB系雄花蕾总RNA的提取及纯化采用Trizol试剂提取西瓜雄花蕾的RNA，DNaseⅠ(RNase-free，5U·μL-1)降解总RNA基因组DNA。用2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，岛津UV-2201型紫外分光光度计定量纯化的RNA浓度，并调整至1g·L-1。1.5反转录PCR（RT－PCR）采用RNAPCRKit（AMV）Ver.2.1(TaKaRa)进行

6、反转录，反应体系及操作步骤按照说明书要求进行。反转录结束后取1μLcDNA进行常规PCR反应，反应体积20μL，反应程序为：94℃2min；94℃30s，40℃45s，72℃20min，30个循环；72℃延伸5min。4℃保存。PCR扩增产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳后银染拍照。1.6差异cDNA条带的克隆、测序及序列分析将差异片段从PAGE凝胶上挖出，放入0.2mL离心管中，加纯水30μL，96℃或煮沸10min，取其中4μL为模板，于25μL扩增体系重新扩增。利用DNA凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回

7、收扩增片段，与pMD18-T载体连接，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞。通过蓝白斑筛选和PCR鉴定阳性克隆，测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。序列进入NCBI数据库进行BLAST分析。2.结果与分析采用Trizol试剂成功地从西瓜G17AB雄性不育两用系雄花蕾中分离出总RNA，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，28S、18S和5SRNA谱带清晰完整（图1-A），但含有基因组DNA。经DNA酶消化，28S、18S和5S的RNA条带清晰，基因组DNA谱带消失（图1-B）；紫外分光光度计检测D260nm

8、/D280nm比值介于1.8～2.0，D260nm/D230nm的比值均大于2.0（表3）。表明，利用Trizol试剂提取西瓜G17AB雄性不育两用系雄花蕾总RNA经DNA酶消化后符合RTPCR的分析要求。2.1西瓜G17AB雄性不育两用系雄花蕾总RNA的提取本试验选用了AAGCT10G、AAGCT10A、AAGCT10C3条锚定引物与26条随