制药工艺综合实验报告-第二组new

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1、制药工艺综合实验报告（发酵及纯化部分）组别：第二组组员姓名：姚玉婷、俞岚、苏畅、付悦、周雯、范秋玥班级：制药1001学院：药学院指导老师：张旦旦、蔡燕飞实验一工程菌的自动罐上发酵【实验目的】1.熟悉微生物培养基配置和常规的灭菌2.掌握基本的工程菌在发酵管上的生长规律3.掌握工程菌发酵工艺控制4.熟悉发酵设备及其相应的控制系统5.掌握SDS－PAGE监测重组蛋白表达【实验器材】1.菌株：工程菌E.coliHB101/pJJ-rhIFNα2B2.仪器：天平、pH计、磁力搅拌器、灭菌锅、超净工作台、、接种环、酒精灯、5L发酵罐、摇床、台式高速离心机、移

2、液枪等。3.玻璃器材：烧杯500ml、250mL、50ml各一个，量筒1L、500mL、100mL各一个，250mL三角瓶×4，Ep管，量杯1L、2L各一个。4.试剂：Typtone、YeastExtract、NaCl、NaOH、MgCl2、NH4Cl等5.培养基配方：(1)LB种子培养基(g/L)：Typtone10，YeastExtract5，NaCl10，调pH7.0，使用前加Amp至100μg/ml。(2)发酵培养基(g/L)：Typtone10，YeastExtract30，KH2PO41，K2HPO4·3H2O5.2，NH4Cl1，K

3、2SO42.6，TESM10ml，使用前加Amp至100μg/ml。（注意：TESM装于三角瓶中，单独灭菌）(3)TE(1L)：0.1mol/LTris，0.05mol/LEDTA，pH7.5【实验步骤及结果记录】1.培养基配置：(1)LB种子培养基：30mL/250ml三角瓶，2瓶；(2)配制发酵培养基3L：称取Typtone30g，YeastExtract90g，KH2PO43g，K2HPO4·3H2O15.6g，NH4Cl3g，K2SO47.8g，加去离子水搅拌溶解后，用去离子水定容至3L，倒入发酵罐。(3)分装30mlTESM于250ml

4、三角瓶，接种前加入发酵罐中。(4)配置200ml30%磷酸，100ml2MNaOH，100ml20%消泡剂盛于流加瓶中。(5)将上述培养基、溶剂、200μl枪头于121℃高压蒸汽灭菌20min。2.氨苄青霉素(AMP)母液100mg/ml，已配置(1)称取氨苄青霉素2g，溶于20mL水中(2)用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装于1.5mLEp管中，冻于－20℃备用。3.种子制备：(1)取30mLLB/250ml三角瓶，加入30μlAmp母液。(2)用接种环从平板保存的HB101/rhIFNα2B划取一环菌，浸没于培养基中并划动接种环，使工程菌分

5、散于培养液中。(3)包好纱布，在摇床上以220rpm的速度，于37℃培养至对数中期（约8小时）。（准备好种子培养基及平板菌种，第一天晚上11点接种。）4.上罐准备：(1)发酵罐于121℃空消20-30min。（早上过来即做，整个灭菌过程约90min！）(2)校正pH及溶氧电极。(3)发酵罐准备：装有培养基的发酵罐，插入pH、溶氧电极，装上空气过滤膜，包扎好后放入灭菌锅中，同时放入TES、消泡剂、磷酸、NaOH等溶液，枪头、离心管等耗材，于121℃灭菌20min。(4)待灭菌结束后，将发酵罐放在冷却底座上，开启发酵罐控制系统，联接好冷凝水、空气线路

6、，调节进气阀使罐内保持正压。（第一天结束）5.发酵取样(1)控制pH=7.2，温度37℃，转速600r/m、通气量1.5vvm（4.5L/min），标定D.O.为100％，校准pH电极。(2)在超净工作台上，将3mlAmp母液加入到装有TESM的三角瓶中，当培养基温度控制到37℃后，接入制备好的种子、TESM，自动控制发酵罐上发酵20小时左右。(3)从接种完时刻起，每两小时取适当量样品，按下述操作：A：取1ml用于测菌体浓度（A600nm），稀释菌液使其读数控制在0.2-0.8，以去离子水做空白（此处菌液一定要摇匀后再测，以防菌体自由沉降）；B：

7、取1ml加入到一称过重ep管中，12000rpm离心，甩干后再次称重（此处一定要甩干，以滤纸或卷纸吸干管内水分），计算菌体湿重，按每8.3mg菌体湿重加入300μL水重悬菌体，冻于-20℃备用C：取1ml于ep管中，冻存于-20℃备用。D：记录发酵罐上溶氧、pH、温度等参数以了解工程菌的生长状态。（第二天结束）稀释倍总吸光度菌体湿重罐上溶氧温度时间A600nmpH数nn*A600nm（mg/ml）（%）（℃）0h10.0930.0930102.47.0236.82h10.2400.2401.8101.07.1036.84h20.6011.2023

8、.994.07.1637.06h100.5295.2912.383.47.2537.18h200.59311.8616.175.87.2