课题3　血红蛋白的提取和分离 (3).pptx

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1、课题3血红蛋白的提取和分离选修1专题5课题背景蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。课题目标1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法；2.说明凝胶色谱法的原理和方法；3.说出电泳的基本原理和方法；4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。以“蛋白质的合成”为背景材料，设计问题，导入新课；首先直接阐明蛋白质提取与分离的依据和原理，接着

2、介绍凝胶色谱法的概念，原理及使用方法；再讲解缓冲溶液的概念，作用；电泳的概念，原理和类型；然后重点讲解血红蛋白的提取和分离过程及注意事项；最后通过课堂总结及课堂检测，完善内化课堂知识。首先通过图片了解血红蛋白的组成，再以鸡血细胞为例，通过洗涤红细胞，释放血红蛋白，分离血红蛋白，透析血红蛋白等一系列实验步骤详细了解具体实验，通过实验提高学生的实际动手能力，并通过实验更好的理解蛋白质提取与分离，为以后的学习打下良好的基础。一、基础知识（一）蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质差异1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其

3、他分子亲和力（二）方法及原理方法原理凝胶色谱法电泳法根据相对分子质量的大小分离蛋白质根据分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同分离蛋白质1.凝胶色谱法（1）材料：凝胶微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。（2）原理：小蛋白质大蛋白质混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子（2）原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。2.缓冲溶液(3)配制：通常由1

4、－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。(1)概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。(2)作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。(4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。3.电泳法（1）概念：指带电粒

5、子在电场作用下发生迁移的过程。（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（3）类型：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小【典型例题】A【方法点拨】蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的()A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品

6、中各种不同蛋白质分离B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。二、实验操作血液组成成分1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白样品处理和粗分离纯化纯度鉴定1.洗涤红细胞血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清

7、液没有黄色（一）样品处理2.释放血红蛋白洗涤好的红细胞导入烧杯加蒸馏水到原血样体积加40﹪体积苯充分搅拌10分钟3.分离血红蛋白红细胞混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质有机溶剂血红蛋白烧杯(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②目的：除去样品中分子量较小的杂质。（二）凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱1.凝胶色谱柱的制作打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管2.凝胶色谱柱的装填50cm高

8、固定色谱柱－配凝胶悬液－装填色谱柱－洗涤平衡沸水浴加热紧密不得有气泡磷酸缓冲液(pH为7.0）