课题3　血红蛋白的提取和分离.pptx

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1、课题3血红蛋白的提取和分离主要内容：一、基础知识二、实验操作一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理㈠凝胶色谱法（分配色谱法）1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法3、原理：分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部运动速度较快较慢运动路径较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来一、基础知识---蛋白

2、质分离和提取的原理4、具体过程一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：2、作用：能够抵制（）对溶液（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱pH值3、缓冲溶液的配制通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3磷酸缓冲液

3、，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性)4、在本课题中使用的缓冲液？（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。在电场

4、的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图4、聚丙稀酰胺凝胶电泳（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。（2）原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质

5、形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:4、聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定血液血浆水分

6、其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团1.血液有哪些成分？2.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定知识回顾（一）样品处理1、红细胞的洗涤：2、血红蛋白的释放：3、分离血红蛋白溶液：4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→

7、反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定分离血红蛋白溶液有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物透析过程动画演示（二）凝胶色谱操作---纯化1、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴

8、定色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱2、凝胶色谱柱的装填步骤操作要求①操作要求色谱柱垂直固定在支架上②计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量③配制悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴④装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打⑤缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h装配好的凝胶柱3、样品加入与洗脱---调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓