课题3　血红蛋白的提取和分离.pptx

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1、课题3血红蛋白的提取和分离第一课时会理县民族实验中学唐贵燕本课题教学目标：1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理；2.体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求；3.掌握血红蛋白提取和分离的基本方法。蛋白质分离的原理根据各种蛋白质特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识㈠凝胶色谱法（分配色谱法）1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2、概念：根据相对分子质量

2、的大小分离蛋白质的有效方法一、基础知识混合物上柱洗脱大分子流动快，小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部运动速度运动路径洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来一、基础知识较快较慢较短较长思考进行体外实验时，如何保证蛋白质不发生变性呢？？1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释

3、不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：2、作用：能够抵制（）对溶液（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱pH值3、缓冲溶液的配制通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内成分：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性)4、在本课题中使用的缓冲液？思考如何检验凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？？（三）电泳：1.概念：带电粒

4、子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图4、聚丙稀酰胺凝胶电泳（1）聚丙稀酰胺

5、凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。（2）原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质

6、间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:4、聚丙稀酰胺凝胶电泳课堂巩固1、凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法：A．分子的大小B．相对分子质量的大小C．带电荷的多少D．溶解度B课堂巩固2．关于电泳的说法不正确的是()A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小C蛋白质的提取

7、和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团1.血液有哪些成分？二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定知识回顾2.你

8、认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？（一）样品处理1、红细胞的洗涤：2、血红蛋白的释放：3、分离血红蛋白溶液：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。二、实验操