耐胆酸革兰阴性菌检查法.doc

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1、耐胆酸革兰阴性菌、大肠埃希菌和沙门菌检查法1．所用方法：平皿法1.1.培养基制备：1.1.1.肠道菌增菌液体培养基制备：1.1.1.1.取脱水肠道菌增菌液体培养基加水配制后，按验证过的高压灭菌程序灭菌备用。1.1.2.紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基制备：1.1.2.1.取脱水紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基加水配制后，按验证过的高压灭菌程序灭菌备用。1.1.3.胰酪大豆胨液体培养基制备：1.1.3.1.取脱水胰酪大豆胨液体培养基加水配制后，按验证过的高压灭菌程序灭菌备用。1.2.供试品检查：1.2.1.阳性对照试验：各取不大于100cfu的大肠埃

2、希菌和铜绿假单胞菌接入肠道菌增菌液体培养基和紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基中，在规定的温度和最短的时间下培养，应检出相应的控制菌。1.2.2.阴性对照试验：1.2.2.1以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。1.2.3.供试液制备和预培养:1.3.3.1.取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”制成1:10供试液，混匀，在20〜25°C培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖(约2小时)。1.2.4.定性试验：1.2.4

3、.1.除另有规定外，取相当于lg或lml供试品的上述预培养物接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30〜35°C培养24〜48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30〜35°C培养18〜24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。1.2.5.定量试验：1.2.5.1选择和分离培养取相当于0.1g、O.Olg和O.OOlg(或0.1ml、0.01ml和0.OOlml)供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30〜35C培养24

4、〜48小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30〜35*C培养18〜24小时。1.2.6.结果判断1.2.6.1若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表2查lg或lml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。1.3.大肠埃希菌1.3.1.供试液制备和增菌培养取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105)”制成1:10供试液。取相当于lg或lml供试品的供试液，接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，

5、混匀，30〜35°C培养18〜24小时。（2）选择和分离培养取上述培养物lml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42〜44*€培养24〜48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30〜35°C培养18〜72小时。1.3.2.结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。1.4.沙门菌1.4.1.供试液制备和增苗培养取10g或10ml供试品直接或处理后接种至适宜体积

6、（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30〜35C培养18〜24小时。1.4.2.选择和分离培养取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，30〜35°C培养18〜24小时。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30〜35t：培养18〜48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18〜24小时，或采用其他适宜方法进

7、一步鉴定。1.4.3.结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色（或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。