5-氮杂胞苷对小麦生长发育及 DNA 甲基化的影响.doc

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1、5-azaC处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化及水稻生长发育的影响表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。表观遗传变异包括:X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。DNA甲基化：在DNA复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。

2、DNA甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化DAM(DNA腺嘌呤甲基转移酶)识别回文序列GATC,在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸)在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化DNA甲基化作用DNA甲基化的生物学意义影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型DNA胞嘧

3、啶甲基化的种类和形成从化头甲基化(denovomethylation)DNMT3a，DNMT3b在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。维持化甲基化(maintenancemethylation)Met1，DNMT1较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化状态给新合成的DNA链上加上甲基。DNA胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：甲基化敏感扩增多态性(MSAP,MethylationSensitiveAmplific

4、ationPolymorphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：重亚硫酸盐测序(Bisulfitesequencing)GCmTACT重亚硫酸钠GCmTATT测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等表1甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果CCmGG不切割CCmGG不切割CCGGMspI不切割CCGGHpaIICmCGGCCGG原始序列内切酶?MSAP流程：提取基因组DNA（注意发育时期和成长状态相同）………ATCCGGTGGCTTGCCmG

5、GAC……………TAGGCCACCGAACGGCCTG……MspI酶切+接头HapII酶切+接头ATCCGGTGGCTTGCCmGGACATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTGTAGGCCACCGAACGGCCTGPCRPCRPAGE电泳PAGE电泳MspI5’…CC(m)GG…3’3’…GGC(m)C…5’HpaII5’…CCGG…3’3’…GGCC…3’?重亚硫酸盐测序实验目的使用不同浓度的5-azaC溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发

6、生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。实验材料1、水稻：日本晴(Oryzasativavarjaponica,nipponbare)2、所需仪器离心机、PCR仪、气浴摇床、水浴摇床、植物生长箱电泳仪、电泳槽、微量移液器、紫外分析仪、分析天平3、试剂（1）植物基因组DNA改良CTAB提取液：bufferA:0.35mol/LSorbitol，0.1mol/LTris-HClpH7.5，0.5mmol/LE

7、DTA;bufferB:0.2mol/LTris-HClpH7.5，0.05mol/LEDTA，2mol/LNaCl，2%CTAB;bufferC:5%N-lauroylsarcosine（2）PCR试剂：TakararTaq，10XPCRbuffer，ddH2O，①预扩增引物：H/M+0:(5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)PCR引物EcoRI+0:(5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)②选择性扩增引物：H/M+AN:5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T,C,G)-3

8、´EcoRI+AN:5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T,C,G)-3´。（3）酶切-连接试剂：EcoRI(NEB)，HapII(NEB)，MspI(NEB)，T4DNAligase，T410xreactionbuffer（4）接头：EcoRIadapter:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’CATCTGACGCATGGTTAAHapII/MspIadapter:5-‘GATCATGAGT