信号通路研究的技术方法.ppt

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1、信号通路研究的技术方法一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定三、DNA重组技术的应用四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用六、细胞信号分子的荧光标记七、细胞信号分子的三维结构分析八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究九、报告基因技术十、蛋白质与核酸相互作用技术十一、对细胞内信号分子的干预技术十二、信号分子基因表达检测技术蛋白激酶磷酸化的检测裂解培养的细胞获得裂解上清以免疫共沉淀法获得蛋白激酶SDS-PAGE再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体以PhosphoAb-HRPWestern化学发光检测试剂盒测定蛋白激酶的磷

2、酸化程度。一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定经典蛋白激酶活性分析实验流程以免疫共沉淀法获得蛋白激酶加入该激酶底物和32-ATP，激酶使底物磷酸化放射自显影，确定磷酸化条带以免疫共沉淀法获得蛋白激酶加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化再加入底物磷酸化特异性抗体以PhosphoAb-HRPWestern化学发光检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进而推出蛋白激酶活性非放射性蛋白激酶活性分析实验流程较传统激酶活性测定方法的优点无需接触放射性物质敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性分析信噪比高低背景系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测

3、试酶活的试剂节约时间：由几天降到几分钟02468101214051020306090120Time(min)RelativekinaseactivityDynamicprocessesofp38activationbyLPSinRAWcellsEffectofindividualMAPKpathwaysonPRAKactivityinintactcellsMKK7(D)GST-ATF2GST-ELK1MKK1(E)MKK6(E)ControlHSP27PRAKControlAniso.ArseniteTNF-80kDa-47kDa-39kDa-80kDa-47kD

4、akDa97.4-68.0-43.9-29.0-18.4-14.3-ControlAniso.ArseniteTNFABThemajorkinasesofp38andp38P38MAPKinasePathwayPhosphopeptidemapofHSP27hosphorylatedbyPRAKinvitroChromatographyElectrophoresispH1.9+MAPKAPK2ChromatographyElectrophoresispH1.9+PRAKChromatographyElectrophoresispH1.9MIX+二、蛋白磷酸化位点

5、分析及其功能鉴定++++----+-HSP27p38GST-PRAK(93A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(212A214A)GST-PRAK(182A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(182D212D)+-+-+-FoldofActivation05101520GST-PRAK(182A)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(93A)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(182D212D)GST-PRAK(212A214A)BAElectrop

6、horesispH8.9++p38-PRAK(182A)+p38-PRAK(182D)p38-PRAK(wt)T182istheregulatoryphosphorylationsiteofPRAKPCRprimerPCRprimer三、DNA重组技术的应用活性诱变体无活性诱变体结构与功能的研究JNK2JNK3JNK1p38p38p38p38ERK1ERK2ERK5TherelationshipbetweenthemembersofMAPKfamilyMAPKDuralPhosphorylationSitesL-12Length**hp38DFGLAR

7、HTDD-------------EMTGYVATRWYRAPE25hP38bDFGLARQADE-------------EMTGYVATRWYRAPE25hp38gDFGLARQADS-------------EMTGYVVTRWYRAPE25hp38dDFGLARHADA-------------EMTGYVVTRWYRAPE25hJNK1DFGLARTAGTS-----------FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK2DFGLARTACTN-----------FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK3DFGLARTAGTS----------

8、-FMMT