信号通路研究思路

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1、证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是：要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，首先要证明P38表达增加会导致损伤。其次，要证明你的药物存在保护作用。再次，证明你的药物可以抑制P38表达。最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。首先证明P38表达增加会导致损伤。这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38ma

2、pk的增高会导致损伤。这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。）其次，要证明你的药物存在保护作用。当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那

3、么可以说你的药物存在保护作用。再次，证明你的药物可以抑制P38表达。用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文

4、章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来

5、抑制运动失调性毛细血管扩张基因突变（ATM)以及DNA-PK。相对而言，MEK1/2的抑制剂U0126和PD98059以及P38MAPK的抑制剂SB203580就要好一些。所以研究人员一般应用LY294002时采用20μM，应用wortmannin时采用0.2μM，以此来最小化其他的效应。有些学者们同时应用两种抑制剂进行对比，也许也有顾及于此的原因吧。但是，从严谨的角度讲起特异性的话，RNAi也不能说是绝对特异的，我们只能说它是高特异性，因为RNAi的机制中还有很多没有完全阐明。一些研究者会在RNAi处理后，还要在实验中应用Western来同时检测该蛋白所在家族的其他成

6、员的表达量变化以检测其特异性和选择性，以表严谨。举个例子：比如针对Survivin进行RNAi之后，你最好同时检测XIAP,cIAP1/2等蛋白。当然，如果你所针对基因的siRNA构建已经很成熟，有前人的文章检测特异性做基础，那就另当别论了，所以给科研态度很严谨的lwjssry兄弟提个醒，如果你的siRNA序列尚无很好的文献应用基础，这个问题你也许应该考虑的。临时找到一个描诉相关内容的06年文献，影响因子3分多，截取其中的内容供lwjssry兄参考吧：信号通路有细胞特异性和条件特异性，即同一信号通路在不同的细胞之间或同一细胞在不同的条件下，作用机理可能是不同的。细胞内的

7、信号通路之间存在复杂的相互作用，想证明哪一个分子是另一分子的充要条件真的很难。本人最近研究了一个信号系统的两个信号分子，A和B。A在细胞质，B在细胞核。以往的研究已经证明A是B的上游信号通路之一。我们的研究是想证明在某种病理过程中A和B作为一个系统发挥作用。我们首先应用能够提升该系统的药物干预，发现A升高的同时B也得到升高，但这也不能说明什么问题。所幸的是A分子目前有特异性的阻断剂，于是我们便对A分子的激活进行阻断，结果发现B分子的激活也收到抑制。由此初步推测A和B可能在某种病理过程中作为一个系统发挥作用。但也只能证明了A是B的必要条件而