细菌sRNA调控靶标的双质粒筛选系统构建.docx

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1、细菌sRNA调控靶标的双质粒筛选系统构建王洪洋胡利华华中农业大学农业微生物学国家重点实验室/蛋白质组学平台(中心)摘要：以pMycVecl/pMycVec2载体为基础，构建了筛选和鉴定细菌sRNA调控靶标的双质粒系统。对pMycVec2载体的多克隆位点进行改造，并加入强启动子rrnBp和有效转录终止子，获得可定向克隆和转录sRNA的质粒pMycVec2-D;对pMycVecl载体的多克隆位点进行改造，并加入弱启动子Pwk和有效转录终止子，获得了分别用报告基因lacZ和GFP来检测sRNA靶标序列翻译水平的质粒pMycVecl-lacZ和pMycVecl-GFP。最后，利用2对已知的sR

2、NA与其调控靶标MicC/ompCmRTA和MicF/ompFmRNA,通过B-半乳糖昔酶活性和菌体荧光值检测，表明双质粒系统能有效检测sRNA与调控靶标的互作。关键词：细菌;非编码小RNA;双质粒系统;调控靶标;作者简介：王洪洋:硕士研究生•研究方向：分子微生物学.E-mail:317020759@qq.com作者简介：胡利华，博士，工程师.研究方向：分子微生物学.E-mail:hulihua@mail・hzau.cdu.cn收稿日期：2017-03-23基金：国家自然科学基金项目(31470170)Construetionofatwo-plasmidsystemforidentif

3、yingtargetsofbacterialsRNAWANGHongyangHULihuaNationalKeyLaborstoryofAgriculturalMicrobiology/CenterforProteomicsResearch,HuazhongAgriculturalUniversity;Abstract：Smallnon-codingRNAs(sRNAs)arcalargenumberofrcgulatorsandarcsignificantlyimportantinphysiologicalprocessesinbacteria.However,fewapproach

4、esareavailableforidentifyingtheircellulartargetsinvivo.Inthisstudy,atwo-plasmidsystembasedontheinitialvectorspMycVec2andpMycVeclwasestablishedtoscreenthetargetsofmycobactcrialsRNA.Thevcctor(pMycVcc2-D)forcloningsRNAwasderivedfromthevectorpMycVec2andcontainedthestrongpromoterrrnBpandaneffectivetr

5、anscriptionterminator,whichhasbeenmodifiedtoenabletightregulationoftheexpressionofsRNA.Thevectorsforcloningtargetgenes,pMycVec1_1acZandpMycVecl_GFP,wereconstructedfromthepMycVecl,whichstabilizedthetranscriptionwithaweakpromoterPwk,andthetranslationleveloftargetwasdetectedthroughthereportergenes.

6、Thetwo-plasmidsystemwasvalidatedbydetectingtheinteractionbetweensRNAanditsregulatorytarget,MicC/ompCmRNAandMicF/ompFmRNArespectively.Keyword：bacteria;smallnon-codingRNAs(sRAs);two—plasmidsystem;regulatorytarget;Received：2017-03-23非编码小RNA(smal1non-codingRNAs,sR-NAs)是新近发现的基因表达调控子，广泛参与细胞的生理代谢活动［1-

7、3］。在细菌屮，第一个发现证实的sRNA是6SRNA,由ssrS基因编码，能直接与RA聚合酶的。互作，负调控依赖于。的启动子，参与生长稳定期的细菌对营养缺乏环境的适应比21。随后，发现大肠杆菌的sRNACsrB能够通过GGA识别模体与调控mRNA翻译及稳定性的RNA结合蛋白CsrA发生相互作用并调控其活性宜。随着测序技术和生物信息学的发展,越来越多的sRNAs及其调控靶标被发现［9-11］。通过sR-NA与其mRNA靶标的序列同源性、相互作用