重组质粒的筛选.docx

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1、重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。一、抗生素平板筛选【实验原理】目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp的抗性基因，因此在含有Amp和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落

2、。大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记，包括氨苄青霉素抗性（Ampr）、卡那霉素抗性（Kanr）、四环素抗性（Tetr）、链霉素抗性（Strr）和氯霉素抗性（Cmlr））等。i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）是青霉素的衍生物，通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。细菌质粒Ampr基因编码b-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的b-内酰胺环。    ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。细菌

3、抗性原理是Cmlr编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。    iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。而Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。    iv）链霉素（Streptomycin，Str）通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。v）四环素（Tetracycline，Tet）通过于30

4、S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。抗生素抗性筛选原理是：不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。【操作步骤】1．制备含有Amp和Kan的LB琼脂培养板2．将100μl转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp和Kan培养板上，37℃培养12-16h。3．在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落

5、即为阳性重组质粒。并将其接种于含Kan的LB液体培养基2ml中培养8-16h。4．小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。二、α互补筛选【实验原理】适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。由α互补而产生的Lac细菌在呈

6、色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。【试剂】1．X-gal（20mg/ml）：将20mgX-gal溶于lml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。2．IPTG（200mg/ml）：将1gIPTG溶于4

7、ml去离子双蒸水中，定容至5ml，用0.22μm过滤器除菌，-20℃保存备用。【操作步骤】1．制备含相应抗生素的琼脂平板。2．于平板表面加X-gal40μl和IPTG4μl，并用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平板表面。37℃静置lh。3．将100μl转化的菌液涂布于平板表面，置37℃培养箱20min后，倒置平板继续培养12～16h。4．中止培养后，将平板静置4℃4h，使蓝色充分显现，平皿上显示蓝色和白色两种菌落。5．挑取白色菌落置2mlLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃摇床培养8～12h。6．

8、提取质粒，以限制性酶切分析进一步鉴定。