戦略的创造研究推进事业经典.pdf

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1、戦略的創造研究推進事業ＣＲＥＳＴ研究領域「内分泌かく乱物質」研究課題「魚類生殖内分泌系に及ぼす内分泌かく乱物質の影響の分子メカニズム」研究終了報告書研究期間平成１２年１１月～平成１７年１０月研究代表者：長濱嘉孝（自然科学研究機構、基礎生物学研究所、教授）１研究実施の概要内分泌かく乱物質は、ヒトを含むいろいろな動物の生体内の正常なホルモン作用をかく乱する物質であり、生殖系、免疫系、脳神経系に影響を与えると考えられている。このような内分泌かく乱物質の影響の原因やメカニズムを明らかにするためには、それぞれの動物に関する基礎的知見の蓄積が必要となるこ

2、とはいうまでもない。本研究で我々は、野生動物に及ぼす内分泌かく乱物質の影響と作用メカニズムを明らかにする目的から、魚類の生殖内分泌系を取り上げ、性決定・分化及び配偶子形成の制御機構に関する基礎的知見をさらに蓄積するとともに、それぞれの過程に及ぼす内分泌かく乱物質の影響と作用メカニズムを解析した。魚類のみならず多くの野生動物の生殖に及ぼす影響でもっとも懸念されることの一つは自然界における性比の混乱であり、内分泌かく乱物質の長期的暴露を考えると将来的には重大な影響を及ぼすことになる。本研究では、この問題を４つの研究グループがお互いにそれぞれの専門

3、分野を背景として協力し合うことによって研究を実施した。研究開始時には、野生動物の性決定、分化の研究は緒についたばかりで本研究で計画された細胞・分子メカニズムについての知見はきわめて少なかった。しかし、内分泌かく乱物質を含む外因性の化学物質の性決定/分化過程への作用メカニズムを正確に判断するには、対象とする生物個体の「遺伝的な性」を知ることが不可欠であると考えられた。そこで、本研究を開始するにあたって、哺乳類以外ではまだ見つかっていなかった性決定遺伝子をメダカ（Oryziaslatipes）から探索する研究を最優先課題として設定した。幸いなこと

4、に、メダカの遺伝的特徴を上手く生かすことにより、研究開始２年目に性決定遺伝子の最有力候補としてDMYをポジショナルクローニングにより単離することに成功した。DMYがメダカの唯一の性決定遺伝子であることは性分化時における遺伝子発現パターン解析、DMYの野生突然変異体の解析及びgain-of-function（XXへのDMYの遺伝子導入によるトランスジェニックメダカの作出）とLoss-of-function（XY個体でのノックダウン実験）により確認することができた。DMYを遺伝子導入することによって作出されたトランスジェニックメダカは、遺伝的背景

5、がXXにもかかわらず正常な精巣が形成され、妊性を有する精子がつくられたのである。マウスでSryを遺伝子導入して作出されたXXトランスジェニック個体では、雄への性転換は誘導されるものの、精巣の発達は異常となり、精子はつくられることはなかった。このように本研究で、脊椎動物で第２番目となるメダカの性決定遺伝子DMYが同定されたが、十数種をこえるメダカ属のなかで、DMYが見つかるのはわずか２種であること、また遺伝子構造が哺乳類のSRY/Sryとはまったく異なることなど、脊椎動物における性決定遺伝子の研究に大きく貢献することができたと考えている。次に、

6、メダカの性決定遺伝子DMYを遺伝子マーカーとして性決定過程に及ぼす性ホルモンや内分泌かく乱物質の影響を調べることが可能となったので、DMY遺伝子の発現に及ぼすアンドロゲンやエストロゲン処理の影響を調べた。その結果、これら性ホルモンはDMYの発現にまったく影響を及ぼさないことが判明した。従って、遺伝的支配にある性決定の過程は性ホルモン等の外因性因子には影響を受けないことが本研究ではじめて明らかとなった。1上記の研究成果から、内分泌かく乱物質が性転換を誘導する際の作用部位は、性決定遺伝子が働いた後の性分化過程、もしくはそれ以降であることが推察され

7、た。そこでこのことを解析するために、すでに生殖腺の性分化に関するある程度の知見が蓄積していて、内分泌かく乱物質が作用すると考えられる体細胞（性ホルモン産生細胞）が大型で細胞学的研究に適しているという特徴を有するティラピア（Oreochromisniloticus）、さらには温度依存性のユニークな性決定システムを示すヒラメ（Paralichthysolivaceus）を用いて研究を進めた。ティラピアは全雌、全雄群（100％）がすでに我々の研究室で確立されていたのでこの方法を駆使することで効率的かつ高精度の研究を推進することができた。この特徴を生

8、かしつつ、EST解析やディフェレンシャルハイブリダイジェーション法等を併用することにより、２つの重要な性分化制御因子、すなわち精巣分化に関するDMRT1と卵巣分化に