基因诊断与基因治疗.ppt

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1、基因诊断与基因治疗(genediagnosisandtherapy)1本章讨论二大方面内容基因诊断基因治疗2一.基因诊断概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。第一节基因诊断3二.基因诊断特点：针对性强，特异性高检测灵敏度和精确性高实用性强，诊断范围广4三.基因诊断常用技术方法核酸分子杂交技术聚合酶链反应（PCR）技术生物芯片基因测序5（一）核酸分子杂交技术核酸分子杂交是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。主要依据：碱基互

2、补、变性和复性DNA与DNA杂交：A=T、G≡C;DNA与RNA杂交:A=U、G≡C;变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；复性：随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链碱基互补6hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC7利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。核酸探针是指带有标记的某

3、一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。探针标记物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。81.核酸分子杂交的分类液相杂交：待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；固相杂交：待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。常用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－92.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针10

4、3.常用固相核酸杂交方法Southern印迹杂交法（Southernblotting）Northern印迹杂交法（Northernblotting）斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/Slotblothybridization）菌落杂交（colonyhybridization）夹心杂交法（sanwichhybridization）原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）11(1)Southern印迹杂交法（Southernblotting）限制性内切酶酶切检测杂交信号提取DNASouthern法可用于检测特异的DNA序

5、列片断、基因定位、分子量测定等。12（2）Northern印迹杂交法（Northernblotting）（其基本过程类似于上述Southern法）提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA13（3）斑点杂交或狭缝杂交法：基本过程：将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。14（4）

6、菌落杂交（colonyhybridization）该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。15（5）夹心杂交法（sanwichhybridization）ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探针片断A检测探针本法优点：特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。16（6）原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。细胞原位杂交组织切片原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA该法优点：不需提取核酸，故可完整

7、保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。有17（二）聚合酶链反应(PCR，polymerasechainreaction)技术PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量扩增。1.PCR基本原理：PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增100万倍以上。18（1）DNA模板的变性将待扩增DNA加热到9

8、50C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性），并游离于反应体系中作为模板；（2）模板与引物的结