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《GBT5009.118-2003小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA).pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ICS67.040C53霭黔中华人民共和国国家标准GBIT5009.118-2003代替GBIT14933-1994小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA)DeterminationofT-2toxininwheatwithenzyme-linkedimmanosorbentassay(ELISA)2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生部*，中国国家标准化管理委员会‘’”GB/T5009.118-2003月叨青本标准代替GB/T14933-1994(小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)).本标准与GB/T
2、14933-1994相比主要修改如下:—修改了标准的中文名称，标准中文名称改为《小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA));—按GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分:化学分析方法》对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:卫生部食品卫生监督检验所。本标准主要起草人:阳传和、罗雪云、计融。原标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。GB/T5009.118-2003小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定(ELISA)范围本标准规定了小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)o本标准适用
3、于小麦及其制品中T-2毒索的测定。本方法的检出限为1拼9/kg。第一法间接法2原理将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加人一定量抗体与待测试样(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原航体复合物。洗除多余抗体成分，然后加人酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原航体复合物相结合，再加人酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。3试荆3。飞甲醇。32石油醚。3.3三抓甲烷。34无水乙醉。3.5乙酸乙醋。3,6二甲基甲酞胺。3.7四甲
4、基联苯胺(TMB),3.8吐温-20;.3.930%过氧化氢(30%H2q)。3.10抗体:杂交瘤细胞系1n7产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。3.11抗原:T-2毒素与载体蛋白一牛血清白蛋白(BSA)的结合物。3.12兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。3.13ELISA缓冲液系统。3.13.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠(Na2COs),2.93g碳酸氢钠(NaHCOs)，加水稀释至1000mL,3.13.2洗液为含。05%吐温-20的pH?.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T).配制方法为:称取0.2
5、g磷酸二氢钾(KH2Pq),2.9g磷酸氢二钠(NaZHPO,·12H20),8.0g抓化钠(NaC1),0.2g氛化钾(KCI),0.5mL吐温-20，加水至1000mL,3.13.3底物缓冲液为pH5。的磷酸一柠檬酸缓冲液，配制方法为:0.1mol/L柠檬酸CCsHa认"H2O)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液;。2mol/L磷酸氢二钠(NatHPO,),即称取磷酸氢二钓71.7g,加水至1。。。mL，为乙液;GB/T5009.118-2003取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。3.13.4底物溶液:取50
6、fALTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酞胺中)溶液+10mL底物缓冲液+10KL30%过氧化氢，混匀。3.14T-2毒索标准溶液用甲醉配成1mg/mLT-2毒素贮备液,-20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20甲醇的PBS(配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。仪器所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。4.1酶标检测仪。4.2酶标板(40孔或96孔)。4.3电动振荡器。4.4电热恒温水浴锅。4.5具。.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。5分析步卑5.1提取称取20g粉碎并通过20目筛的试祥，置2
7、00mL具塞镶形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷一无水乙醇(4-}-1),密塞，振荡1h,通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。用50ml，石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗人250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇一水(4+1)分次洗涤，转人同一分液漏斗中，振摇1.5min,静置约15min，收下层甲醇一水提取液过层析柱净化(层析柱的装备:在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装人。5g中性氧化铝，敲平表面，再加人0.49活性碳，敲紧)。将过柱后的洗脱液倒人蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙醋
8、，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙醋，冷至室温后转人
