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《GBT14933-1994 小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法( ELISA).pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中华人民共和国国家标准小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附GB/T14933一94测定方法(ELISA)MethodfordeterminationofT-2toxininwheatwithenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)1主题内容与适用范围本标准规定了谷物中T-2毒素的酶联免疫吸附侧定方法(ELISA),本标准适用于小麦及其制品中T-2毒索的测定。本方法的最低检出量为1fig/kg,第一篇间接法2原理将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原一
2、抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原一抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪.测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。3试剂本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或用等纯度的水。3.1甲醉。3.2石油醚。3.3三氯甲烷。3.4无水乙醇。3.5乙酸乙酷。3.6二甲基甲酥胺。3.7四甲基联苯胺(TMB)>3.8吐温-20.3.930%过氧化氢00%1-120}).3.10抗体;杂交瘤细胞系1D7产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。3.
3、11抗原:T-2毒素与载体蛋白一牛血清白蛋白(BSA)的结合物。3.12兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。3.13ELISA缓冲液系统3.13.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盆缓冲灌竺趁垂)些9g丝垫旦吵四止三之业卫遇渔邀中华人民共和国卫生部1994-01一24批准1994一08-01实施GB/T14933一94(NaHCO,)，加水稀释至1000mLo3.13.2洗液为含。.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为:称取磷酸二氢钾(KH,P04)0.2g,磷酸氢二钠(Na,HPO,·12H,0)2.9g,氯化钠(NaCI
4、)8.0g,氯化钾(K000.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mLo3.13.3底物缓冲液为pH5.。的磷酸一柠檬酸缓冲液，配制方法为:0.1mol/L柠檬酸(C,He0,-H,0)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液;0.2mol/L磷酸氢二钠(Na,HP04)，即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL，为乙液;取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。3.13.4底物溶液:取50pLTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酞胺中)溶液+10mL底物缓冲液+10pL30%过氧化氢，混均。3.14T-2毒素标准溶液用甲醇
5、配成1mg/mLT-2毒素贮备液,-20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲醇的PBS(配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。4仪器所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。4.1酶标检测仪。4.2酶标板(40孔或96孔)。4.3电动振荡器。4.4电热恒温水浴锅。4.5具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。5分析步骤5.1提取称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷一无水乙醇(4:1),密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干
6、。用50mL石油醚分次溶解燕发皿中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇一水(4:1)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min，静置约15min，收下层甲醇一水提取液过层析柱净化(层析柱的装备:在层析柱下端与小管相连结处塞约。.Ig脱纸棉，尽量塞紧，先装人0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入。.4g活性碳，敲紧)。将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酷，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙醋，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙醋洗涤燕发皿，并人浓缩瓶中.将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PB
7、S定容，供ELISA检测之用。5.2ELISA检测5.2.1用T-2-BSA(4pg/mL)包被酶标板，每孔100pL,4℃过夜;5.2.2酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加人不同浓度的T-2标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品中的毒素含量)与抗体溶液的混合液(1}1，每孔100pL，该混合液应于使用的前一天配好，4℃过夜备用)，置370C1h,5.2.3酶标板洗3次，每次3min后，加入酶标二抗，每孔100pL,370C1.5h=5.2.4同上述洗涤后，加人底物溶液，每孔100pL,370C30min=5
